分享
2022年3月23日，由中国医学科学院病原生物学研究所联合中日友好医院（中国医学科学院呼吸病学研究院）、四川大学华西医院和中国医学科学院牛津研究所（牛津大学）等单位在传染病权威期刊《The Lancet Microbe》在线发表论文，揭示COVID-19康复患者在感染1年后体内仍存有SARS-CoV-2特异性抗体和T细胞免疫反应。中国医学科学院病原生物学研究所王健伟教授和中日友好医院曹彬教授为共同通讯作者。中国医学科学院病原生物学研究所郭丽，四川大学华西医院王赓，中日友好医院王业明，中国医学科学院病原生物学研究所张乔、任丽丽，中日友好医院谷晓颖为共同第一作者。
截图来源：https://www.thelancet.com/journals/lanmic/article/PIIS2666-5247(22)00036-2/fulltext
一、研究背景
在COVID-19患者在康复后，SARS-CoV-2特异性抗体水平随着时间的推移而下降，而感染后8个月仍可以检测到病毒特异性细胞免疫反应。记忆性免疫反应对于预防再感染和减轻疾病严重程度至关重要。对感染SARS-CoV后康复患者的研究表明，细胞免疫反应可以维持近20年，而大多数个体无法检测到记忆性B细胞和抗体反应。但是，COVID-19患者感染康复后针对SARS-CoV-2体液免疫和细胞免疫反应的持续时间、强度和功能尚未完全阐明。
二、研究方法
该研究对COVID-19出院患者进行了两次随访，随访中位时间为发病后6个月和12个月。在感染后12个月共收集了1096例患者外周血样本，对应感染后6个月的配对样本为141例。利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了SARS-CoV-2核衣壳蛋白（N）、刺突蛋白（S）和受体结合域（RBD）的IgM、IgA和IgG抗体水平，利用活病毒微量中和试验分析了针对SARS-CoV-2 Wuhan株和D614G、Beta和Delta变异株的中和抗体（NAbs）水平，进一步利用酶联免疫斑点（ELIspot）和胞内细胞因子染色（ICS）方法对其细胞免疫水平进行了评估。
三、研究结果
1、SARS-CoV-2的结合抗体分析
感染后12个月，康复患者的N-IgG、S-IgG、RBD-IgG和中和抗体的血清阳性率分别为82.0%、95.2 %、94.2 %和86.2 %。重症患者 S- IgG抗体滴度高于中症患者（p=0.017）。感染后12个月，SARS-CoV-2 IgG滴度随年龄增加，具有肌无力、脱发和头痛患者的SARS-CoV-2特异性抗体水平高于未报告相关症状的患者。
图1. COVID-19患者感染后12个月不同疾病严重程度和年龄组血浆N-，S-，RBD-IgG抗体滴度
2、中和抗体可维持12个月，感染6-12个月后中和抗体水平呈下降趋势
对141位患者感染后6个月和12个月的配对血浆进行检测，SARS-CoV-2中和抗体阳性率分别为85.8% （121/141）和81.6% （115/141）（p= 0.33）。总体来说，感染后12个月中和抗体滴度（中位数1/25.1 [IQR 1/12.6-1/40]）低于感染后6个月 （中位数1/25.1 [IQR 1/13.4-1/50.1]）。感染12个月后，危重症组（1/28.2 [IQR 1/15.8 - 1/35.1] vs 1/29.5[IQR1/22.4 - 1/56.2] ） （p = 0.038）及≥60岁年龄组（1/24.3 (IQR 1/11.3 - 1/40.0] vs 1/31.6 [IQR 1/15.9 1/50.1]）（p = 0.0008）中和抗体滴度低于感染后6个月。上述结果提示，中症、重症和危重症COVID-19患者感染后6-12月，中和抗体总体水平呈下降趋势，但中和抗体维持较高阳性率（85.8% vs 81.6%）并保持稳定。
图2. SARS-CoV-2感染后6个月和12个月康复患者的中和抗体反应及动力学变化
3、感染后12个月仍具有SARS-CoV-2特异性记忆性T细胞免疫反应
在2019年前采集的健康人群中，26.3%（5/19）检测到SARS-CoV-2的特异性γ干扰素（IFN-γ），提示SARS-CoV-2与季节性冠状病毒存在交叉细胞免疫反应。在90.0% （72/80）的COVID-19康复患者中检测到记忆性T细胞反应，SARS-CoV-2特异性T细胞对至少一种SARS-CoV-2肽库产生免疫应答。但是，SARS-CoV-2特异性T细胞反应在不同个体间具有高度异质性，而SARS-CoV-2记忆T细胞反应水平与疾病严重程度之间无显著相关性（p= 0.42）。
图3. IFN-γ ELISpot检测记忆T细胞对SARS-CoV-2多肽的特异性反应
4、感染后12个月康复患者存在较强的SARS-CoV-2特异性CD4+和CD8+ T细胞免疫反应
ICS检测结果发现，CD4+ 和CD8+ 抗原特异性T细胞至少产生IFN-γ、白细胞介素2（IL-2）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）细胞因子中的一种。 CD4+ 和CD8+ T细胞对SARS-CoV-2的S （p=0.21和p=0.77）、M/E/ORF （p=0.47和p=0.72）肽库反应的比例在中症、重症和危重症患者中无显著差异。 然而，与中症和危重症患者相比，重症患者CD4+ （p= 0.0032和p= 0.0017）和CD8+ （p= 0.019和p= 0.0034）T细胞对N肽库反应的比例较低。 S和N肽库刺激比M/E/ORF肽库刺激可诱导更多的IL-2和TNF-α （p=0.010，p=0.026, p<0·0001，p=0.0002）。
图4. SARS-CoV-2特异性T细胞在COVID-19康复患者中的功能特征
5、感染后12个月，与Wuhan株相比，康复患者针对变异株中和抗体反应减弱，而细胞免疫未受明显影响
为了明确感染后12个月康复患者的血浆抗体是否可以中和目前流行的SARS-CoV-2变异株，利用活病毒微量中和试验检测了141名康复患者血浆对D614G、Beta和Delta变异株的中和能力。结果显示，在感染12个月后，81.6% （115/141）的个体对SARS-CoV-2 Wuhan株具有中和抗体活性。相比之下，只有48.2% （68/141）、22.7% （32/141）和48.9%（69/141）的个体对D614G、Beta和Delta变异株表现出中和抗体反应（p<0.0001）。D614G株 （中位数5.0 [IQR 5.0-14.1]）（p<0.0001）、Beta株（中位数5.0 [IQR 5.0- 5.0]）（p<0.0001）和Delta株（中位数5.0 [IQR 5.0-15.8]）（p<0.0001）的中和抗体滴度显著低于Wuhan株（中位数25.1 [IQR 12.6- 40.0]）。针对D614G株和Delta株的中和抗体水平相当（p= 0.42），均高于Beta株（p= 0.036和p=0.0019）。上述结果提示，感染后12个月，与Wuhan株相比，康复患者针对变异株的中和抗体反应减弱。进一步的数据显示，针对Wuhan株具有更高的中和抗体滴度有助于对D614G株和Delta株的保护。与D614G株和Delta株相比，针对Wuhan株产生的中和抗体对Beta株的中和能力更弱，而且Beta株从针对Wuhan株中和抗体中逃逸的能力与抗体滴度无关，表明Beta株的变异影响了中和抗体与病毒S蛋白的结合。
为了研究Wuhan株和Beta株在T细胞反应上的差异，我们利用Wuhan株和Beta株的全长S蛋白重叠肽库进行了IFN-γ ELIspot和ICS检测。ELIspot结果显示，不同个体对SARS-CoV-2特异性IFN-γ反应具有异质性。但是，利用Wuhan株和Beta株肽库刺激后，二者的SARS-CoV-2特异性IFN-γ的整体反应没有差异（p= 0.70），并显示了较强的相关性（Spearman r= 0.85, p< 0.0001）。ICS结果显示，Beta株在CD4+ T细胞反应中诱导了更强的TNF-α反应（p= 0.012），在CD8+ T细胞反应中诱导了更强的IFN-γ反应（p= 0.024）和TNF-α反应（p= 0.013)。这些结果提示，感染后12个月，与Wuhan株相比，康复患者针对变异株细胞免疫未受明显影响。
图5. SARS-CoV-2武汉株、D614G株、Beta株和Delta株的中和抗体和细胞免疫反应
6、感染后12个月在中和抗体阴性者中仍可以检测到细胞免疫反应
感染后12个月，T细胞ELIspot IFN-γ反应与中和抗体 （Spearman r= 0.10， p= 0.34）、S-IgG （Spearman r=- 0.062，p= 0.59）、N-IgG （Spearman r=- 0.052，p= 0.65）、RBD-IgG （Spearman r=0.14，p= 0.23）滴度均无相关性。为了评估T细胞反应与抗体反应的关系，我们从26/141例（18.4%）感染后12个月中和抗体阴性的康复患者中选择了16例患者，检测了其SARS-CoV- 2特异性细胞免疫反应。ELIspot结果显示，15/16（93.8%）的个体表现出记忆性IFN-γ反应。在ICS试验中，在CD4+和CD8+特异性T细胞应答中，所有16个样本至少产生3种细胞因子（IL-2、IFN-γ和TNF-α）中的1种。这些结果提示，感染后12个月，部分个体虽然检测不到中和抗体，但是细胞免疫依然存在。
图6. SARS-CoV-2武汉株、D614G株、Beta株和Delta株的中和抗体和细胞免疫反应
四、研究结论
感染后12个月康复患者体内仍然存在针对SARS-CoV-2的特异性中和抗体和T细胞反应。与Wuhan株相比，针对D614G株、Beta株和Delta株的中和抗体水平明显降低；而SARS-CoV-2变异株没有明显逃逸记忆T细胞反应。这些结果提示，当中和抗体水平降低时，SARS-CoV-2特异性T细胞反应可能对SARS-CoV-2变异株导致的严重疾病发挥重要保护作用。为评估SARS-CoV-2感染后诱导体液免疫和细胞免疫的持久性以及对新出现的变异株免疫反应，需开展随访时间更长的COVID-19的队列研究。
