引言

寻找病原学证据，是肺部感染性疾病诊治过程中的重中之重。传统的病原学检测需要的时间较长，且无法覆盖全部病原，临床中需要快速的病原诊断技术。病原体靶向基因检测（tNGS）相较于mNGS，极大地提高了检测敏感性，且可以同时兼顾DNA和RNA流程，并很大程度上缩短了检测时间，具有性价比高、可定制化的特点，是一个可应用于多场景的技术平台。本文主要通过多个进行临床中的tNGS应用实例分享，力求发现tNGS在肺部感染性疾病诊断中的优点与不足之处，希望能为同道提供一些参考价值。

基础病均为支气管扩张，咯血2年、1年和间断咯血4天的患者，给予我们哪些启示？……患者均合并感染，如何以最快速度诊断？

讲述者：李丽娟

【病例一】：67岁男性患者，主诉“咳嗽、咳痰、咯血2年”入院。

当地医院给予头孢哌酮舒巴坦联合左氧氟沙星，治疗效果不佳。患者既往有类风湿关节炎，支气管扩张、高血压等疾病病史。肺部CT示：右肺上叶可见空洞影，大小约4.2cm×5.8cm。

这名患者以“肺部空洞待查”入院，入院后查血G实验（-）、GM实验（-），曲霉菌IgG（-）。结核杆菌感染γ干扰素实验T-spot（-），痰分枝杆菌鉴定及药敏Xpert（-），因此不考虑肺结核。根据影像学，需要考虑曲霉感染或毛霉感染可能，且患者有咯血，家属拒绝气管镜，因痰真菌培养时间较长，故选择痰tNGS。

痰tNGS示：铜绿假单胞菌，序列数80，烟曲霉 序列数 50，具核酸杆菌 序列数1470。

根据tNGS结果调整抗感染药物为头孢哌酮舒巴坦和伏立康唑治疗。5天后，我院的痰真菌培养回示为烟曲霉。虽然痰细菌培养（-），但tNGS示铜绿假单胞菌，故继续给予头孢哌酮舒巴坦治疗，患者咯血消失，咳嗽、咳痰症状好转，目前治疗1月左右，尚未复查CT。

【病例二】：38岁女性患者，主诉“间断咯血1年”入院。

这位患者1年前因咯血，外院支气管镜检查诊断为“诺卡菌”感染，给予口服复方磺胺甲噁唑治疗1年，患者血肌酐升高，且治疗效果不佳，再次出现咯血，收入我院呼吸科。肺部CT示：双肺下叶支气管扩张，部分支气管腔内粘液栓，考虑支气管扩张合并感染。

患者入院后，查白细胞正常，降钙素原正常，血G实验、GM实验（-），曲霉菌IgG（-），T-spot（-）。这时患者再次出现咯血，量约30ml，给予对症止血治疗后出血停止。

这时我们要思考，患者的致病病原依然是诺卡菌吗？因患者无痰，给予支气管肺泡灌洗液（BALF）检查。考虑到其长期口服复方磺胺甲噁唑，且入院后给予利奈唑胺和阿米卡星治疗，担心常规的培养无法检出诺卡菌，故这时需要加做tNGS。

BALF-tNGS示：脓肿诺卡菌，序列数 115，烟曲霉 序列数26450。

我院BALF细菌培养阴性，真菌培养为烟曲霉，根据药敏，给予伏立康唑治疗。因患者tNGS仍有诺卡菌，复方磺胺甲噁唑不耐受，继续利奈唑胺和阿米卡星治疗，其咯血症状明显好转。

【病例三】：35岁女性患者，主诉“间断咯血4天”入院。

这位患者当地医院先后给予左氧氟沙星和云南白药等止血药物治疗，效果不佳。肺部CT示：右肺下叶囊性支气管扩张影，腔内曲霉球，周围伴有渗出影。

入院后，我们完善检查了外周血白细胞正常，血清G实验（-）、GM实验（-），曲霉菌IgG（-），T-spot（+），Xpert（-），因患者咯血，急需抗感染治疗减轻咯血症状，且影像学高度怀疑曲霉，需要尽可能快速的病原检测，故行痰tNGS示：具核酸杆菌 序列数 748，咽峡炎链球菌群 序列数 88，人冠状病毒NL63 序列数36344，单纯疱疹病毒I型 序列数20。

问题来了，冠状病毒感染能解释患者磨玻璃影，但不能解释空洞病变，故给予积极止血治疗5天后行支气管镜检查。肺泡灌洗液tNGS示：烟曲霉 序列数 270，人冠状病毒NL63，序列数 47，BALF-GM实验：1.52，BALF真菌培养（-）。

给予伏立康唑治疗后，患者出现心悸、胸闷、全身疼痛。之后又调整为艾沙康唑，后患者未再有咯血。目前处于随访中。

思考题：这3位患者病例有哪些共同点和不同点？tNGS检测是否能帮助他们快速明确病因？对于他们的病情而言，这项检测的优势在哪？

以上这3个病例，分别为咳嗽、咳痰伴咯血2年、间断咯血1年和间断咯血4天的患者，三位患者的基础病均为支气管扩张，且均合并曲霉感染。在曲霉菌的诊断上，目前有传统的真菌培养，但需要时间很长，且依赖于微生物室水平；BALF-GM诊断依赖于患者必须要能够耐受气管镜，且阴性亦不能除外曲霉菌感染，故tNGS检测能够快速地明确曲霉诊断，BALF-tNGS的准确度高于痰tNGS。

3例以“咳嗽、咳痰”为主诉，其中一青年女性病史长达30余年……对双肺部分支气管扩张合并感染者果断行肺泡灌洗液tNGS检测

【病例四】：72岁男性患者，主诉“发热伴咳嗽、咳痰2周”入院。

当地医院先后给予头孢哌酮舒巴坦、美罗培南、多西环素和甲强龙，治疗效果不佳。肺部CT示：双肺实变渗出影。

入院后，查血常规示白细胞正常，D-Dimer>20mg/L，且患者鼻导管吸氧6L/分下血氧饱和度在93%，血气分析示I型呼吸衰竭，考虑重症肺炎。这时急需要病原学指导抗感染治疗，故留取痰tNGS。

痰tNGS示：烟曲霉 序列数 4027，土曲霉复合群 序列数1496，小孢根霉 序列数 11，白念珠菌 序列数 496，人腺病毒B组 序列数27447。

患者腺病毒合并曲霉菌诊断明确，给予伏立康唑治疗，同时对症退热。患者体温在1周内降至正常，呼吸衰竭好转出院。因小孢根霉序列数很少，暂时未处理，1个月后，患者于当地复查肺部CT，较前有明显好转。

【病例五】：36岁女性患者，主诉“反复咳嗽、咳痰30余年，加重4月”入院。肺部CT示：双肺部分支气管扩张合并感染。

入院后，查血常规WBC 9.81×10^9 ，Neut 7.07×10^9 ，Lym 2.1×10^9，降钙素原（-），血清G实验（-）、GM实验（-），曲霉菌IgG（-），T-spot（-），Xpert（-）。BALF-tNGS示：铜绿假单胞菌 序列数16112，卡他莫拉菌 序列数 170，我院BALF培养示粘液性铜绿假单胞菌。

给予哌拉西林他唑巴坦联合环丙沙星抗感染治疗后，患者明显好转，目前我院分枝杆菌培养尚在培养中。

【病例六】：18岁男性患者，主因“咳嗽、咳痰、痰中带血丝2月”入院。

肺部CT示：双肺部分支气管扩张合并感染。既往糖尿病病史，血糖控制极差。

患者入院后查白细胞正常，T-spot（+），G实验（-），GM实验（-），因患者无痰，给予支气管镜检查，我院Xpert（-），BALF-tNGS示：结核分枝杆菌复合群 序列数59028，支原体属 序列数 12，肺炎克雷伯菌 序列数 762，百日咳鲍特菌 序列数 21。

给予抗结核治疗。因患者合并肺炎克雷伯杆菌和肺炎支原体感染，给予左氧氟沙星治疗，患者症状明显好转。因患者的百日咳鲍特菌序列数很少，暂时未处理。1月后，我院BALF分枝杆菌培养示结核分枝杆菌。

思考题：此3例中为何那位青年女性患者长达30余年没能明确诊断？对双肺部分支气管扩张合并感染者，是否要更加果断行肺泡灌洗液tNGS检测？

这3个病例中，患者均以“咳嗽、咳痰”为主诉，其中第2例是一位青年女性，病史更是长达30余年，因患者未至大型医院就医而未能明确感染诊断；第1例的重症肺炎患者，tNGS很快地发现了曲霉菌和腺病毒，为其积极诊治争取了时间；第3例患者在我院结核分枝杆菌鉴定及药敏阴性的基础上，tNGS测出结核分枝杆菌，亦为患者针对性治疗争取了时间。

4例主诉为“咳嗽、胸闷伴喘憋”，共同特点是呼吸困难……通过肺泡灌洗液tNGS有何新发现？其中一位患者为何多次做痰tNGS检测？

【病例七】：62岁男性患者，主诉“反复咳嗽、胸闷、呼吸困难1年余，加重3天”入院。

患者应用头孢类药物后效果不佳，肺部CT示：双肺支气管扩张合并炎症。

入院后，完善检查示白细胞正常，T-spot（+），血清G实验（-），GM实验 0.83， 曲霉菌 IgG（-)。从影像学上考虑特殊感染可能，为尽可能明确病原学，给予支气管镜检查，BALF-GM（-），BALF-tNGS示：圣乔治诺卡菌 序列数 14224，鼻病毒C型 序列数 37866。但我院BALF-xpert和分枝杆菌培养均阳性，考虑结核诊断。

给予患者抗结核和针对诺卡菌治疗，症状明显好转。

【病例八】：56岁男性患者，主诉“反复呼吸困难1年余，加重伴发热1月余”入院。

该患者因过敏性肺炎长期口服糖皮质激素治疗，入院前1个月全身乏力、发热、咽痛加重。肺部CT示：双肺磨玻璃病变、小叶间隔增厚、牵拉性支气管扩张。

患者入院后，我们考虑为间质性肺疾病较前加重，从影像学上很难区分是否合并感染。T-spot（-），血清G实验（-），GM实验（-）， 曲霉菌 IgG（-)。

我院查痰甲流核酸H1N1阳性，但这仅仅是流感吗？支气管镜检查示甲流核酸H1N1阳性，CMV核酸阳性。此时，tNGS亦是鉴别间质性肺炎是否合并感染的手段之一。

BALF-tNGS示：甲型流感病毒H1N1 序列数6382， 巨细胞病毒 序列数 2119，EB病毒 序列数 83。

至此，考虑为间质性肺炎合并H1N1和CMV病毒感染，给予抗病毒治疗后，患者很快好转。

【病例九】：82岁男性患者，主诉“咳嗽3月余，加重伴喘憋1月余”入院。

患者入院前3个月，因ANCA相关性小血管炎长期口服糖皮质激素治疗，近期出现呼吸困难加重。肺部CT示：双肺网格和磨玻璃病变、小叶间隔增厚、牵拉性支气管扩张。

入院后，考虑间质性肺疾病较前加重，但他是间质性肺炎加重还是合并感染呢？如何区分？患者吸氧流量50%，气管镜风险很高，如何明确病原学？

我院查G实验 152.31pg/ml，GM实验（-），T-spot（-），Xpert（-），因患者长期糖皮质激素应用，且未规律应用复方磺胺甲噁唑预防肺孢子菌，需要警惕肺孢子菌合并巨细胞病毒肺炎的可能，且患者病情危重，急需要病原结果，故紧急联系痰tNGS。

痰tNGS示：肺孢子菌PCP 序列数 2125，热带念珠菌 序列数12076， 白念珠菌 序列数 32961，单纯疱疹病毒I型 序列数 112，CMV 序列数 90，EBV 序列数 6239。

之后我院查CMV、EBV和PCP核酸阳性，给予磺胺和更昔洛韦治疗，患者症状一度好转，但2周后又再次出现咳嗽、咳痰，黄痰，喘憋加重，再次痰tNGS示：米根霉 序列数362，热带念珠菌 序列数20909， 白念珠菌 序列数 43028，CMV 序列数 141。

既然考虑为米根霉感染，立即加用艾沙康唑抗感染治疗，患者症状很快好转（我院查痰真菌培养多次示白念珠菌，未见米根霉）。患者治疗1个月左右，咳嗽、咳痰、喘憋明显好转，给予环磷酰胺和糖皮质激素治疗ANCA相关性小血管炎。

之后，患者又再次住院行环磷酰胺注射，出现咳嗽、咳痰，喘憋加重，伴低氧血症。再次痰tNGS示：肺炎支原体 序列数951，大环内酯类耐药，克柔念珠菌 序列数 233391，热带念珠菌 序列数10957， 白念珠菌 序列数 17185。

给予莫西沙星治疗支原体后，患者症状好转，继续注射环磷酰胺治疗血管炎。

【病例十】：62岁男性患者，主诉“咳嗽、气短10余年，加重伴间断发热2月”入院。

这位患者既往慢性阻塞性肺疾病诊断明确，目前吸入布地格福治疗。患者反复因慢阻肺病而住院，给予静脉糖皮质激素治疗。2个月前出现反复发热，每次发热时伴关节疼痛，最高至39℃，当地医院给予静脉糖皮质激素和头孢等抗生素可好转，但患者依然反复发热，约10-15天发作一次。

10天前，再次出现发热，头孢哌酮舒巴坦和静脉甲基强的松龙能缓解症状，停药后反复，为进一步诊治收入院。肺部CT示：支气管炎，肺气肿，肺大泡，双肺炎性病变，右肺为著。

入院后，查血常规示：WBC 6.73×10^9 ，Neut 5.95×10^9 ，Lym 0.61×10^9，降钙素原（-），T-spot（-），G实验（-），GM实验（-），痰Xpert（-）。我院病毒核酸12项均（-），患者发热原因不明，且慢阻肺病终末期的患者肺功能极差，气管镜检查有一定的风险，故行痰tNGS检查。

痰tNGS示：肺炎克雷伯杆菌 序列数122，大肠埃希菌 序列数 90，鲍曼不动杆菌 序列数 1281，小孢根霉 序列数705， 肺孢子菌 序列数 703，EBV 序列数6584。

考虑患者长期应用糖皮质激素相关的免疫功能低下感染，给予头孢哌酮舒巴坦，联合艾沙康唑和复方磺胺甲噁唑治疗后好转，之后未再发热。

思考题：4例主诉为“咳嗽、胸闷伴喘憋”、共同特点为呼吸衰竭的病例，为何tNGS依然能成为其鉴别诊断之要？

这4例主诉为“咳嗽、胸闷伴喘憋”的患者，其共同特点为呼吸衰竭。第1例患者tNGS未检出结核，我院经过Xpert和分枝杆菌培养明确，后2例为弥漫性间质性肺炎是否合并感染的鉴别诊断，tNGS能在很短时间内明确患者是否合并感染，利于呼吸衰竭的患者尽快明确病原学，第4例为发热患者的鉴别诊断，因肺部CT不典型，常规抗感染无效，tNGS常常能告诉我们发热的原因。

严重的肺部感染，亟需病原学来指导抗感染药物应用，tNGS可同时测耐药基因及毒力基因……优势、临床总结应用以及发现的不足之处

通过临床应用实践，我们认为tNGS具有的优势：

其一，价格更便宜。由于tNGS无需去人源化，直接对靶向基因进行测序，所需测序数据量较小，相比较而言测序更快，价格更便宜。目前市场上的mNGS通常在几千元（DNA+RNA），而tNGS价格在1000元左右，甚至有公司的小panel靶向产品价格降到了千元以下，这种价格不仅与mNGS相比有优势，与多重荧光定量PCR相比价格也不太贵，但能做的微生物种类有相当大的优势；

其二，检测更加灵敏。由于tNGS首先用特异性的引物或探针对目标微生物的核酸进行富集再进行测序，因此可以检测出浓度很低病原微生物，检测灵敏度上比mNGS更有优势[1]；

其三，可以同时测耐药基因及毒力基因。mNGS检测获得的常规数据量中特定微生物的序列数一般不足样本总序列数的5%，特异性序列覆盖度通常不到特定微生物基因组的1%，因此几乎不可能用于特定微生物的耐药基因及毒力基因进行突变分析。而tNGS可以通过引物或探针对耐药基因及毒力基因进行富集测序，检测出耐药及毒力[2-4]；

其四，速度快。mNGS只需要24小时即可出结果，在临床中有些患者急需要病原，但传统的检测太慢，不能满足快速的要求，如细菌培养、真菌培养，尤其真菌检测，tngs有很好的应用价值。

临床总结应用：1、严重的肺部感染，亟需病原学来指导抗感染药物应用；2、特殊感染，如真菌感染，结核感染，病毒感染，经常在24小时内获取病原，敏感性远远高于传统的细菌和真菌培养，有助于临床指导用药；3、弥漫性间质性肺炎，临床上无法区分是间质性肺炎加重亦或合并感染，tNGS能鉴别近200种常见的病原感染；4、患者无法耐受支气管镜或风险偏大时，痰tngs也是一个很好的选择，需要留取合格痰液；

我们也发现了tNGS的一些不足之处，希望与同道们一起探讨：1、结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌分辨率不够高，有时需要结合xpert和分枝杆菌培养；2、因留取标本或实验水平有误差时，出现跟临床不相符的时候，建议复测；痰tNGS没检出病原的时候，建议有条件的可选择支气管BALF或复测一次痰tNGS；3、tNGS无法覆盖所有的病原感染，当怀疑更少见的感染时，建议mNGS检查。

本期点评

1、tNGS技术是近几年进入到临床视野的靶向高通量测序技术，它能将「PCR」和「NGS」的优势结合，采用超多重PCR正向富集目标病原，提升检测灵敏度，同时可以排除宿主核酸干扰，经测序和生信分析可实现不同症候群、感染脏器、患者类型等多种临床场景的核心病原鉴定；

2、在实际应用中，面对疑似感染的患者，可率先使用靶向测序技术将常见的病原微生物以及相关耐药信息提供给临床，在感染初期就帮助锁定病原；

3、若患者所感染的病原体不在所采用的靶向范围内，则可能属于相对罕见，甚至是新发的病原体。到这个阶段，作为疑难感染疾病的终极解析方案，便可启动宏基因组测序，以最终帮助确定病原。

参考资料

1.Mitchell SL, Simner PJ. Next-Generation Sequencing in Clinical Microbiology: Are We There Yet? Clin Lab Med. 2019 Sep;39(3):405-418.doi: 10.1016/j.cll.2019.05.003. PMID: 31383265.

2.Wu SH, Xiao YX, Hsiao HC, Jou R. Development and Assessment of aNovel Whole-Gene-Based Targeted Next-Generation Sequencing Assay for Detecting the Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to 14Drugs. Microbiol Spectr. 2022 Dec 21;10(6):e0260522. doi:10.1128/spectrum.02605-22. Epub 2022 Oct 18. PMID: 36255328; PMCID:PMC9769975.

3.Sibandze DB, Kay A, Dreyer V, Sikhondze W, Dlamini Q, DiNardo A, et al. Rapid molecular diagnostics of tuberculosis resistance by targeted stool sequencing. Genome Med.2022 May 19;14(1):52. doi: 10.1186/s13073-022-01054-6. Erratum in:Genome Med. 2022 Sep 20;14(1):107. PMID: 35585607; PMCID: PMC9118838.

4.Lin A, Singh A, Allred A, Allard M, Waltman D, Imanian B, et al. Targeted Next Generation Sequencing Assay for Direct Detection and Serotyping of Salmonella from Enrichment. J FoodProt. 2024 Feb 28:100256. doi: 10.1016/j.jfp.2024.100256. Epub aheadof print. PMID: 38428461.

专家介绍

李丽娟

博士，中日医院呼吸与危重症医学科主治医师（副主任医师资格），CHEST-PCCM医师，支持院内基金若干项，参与国家科技支撑和北京市科委的基金若干项，2019年于美国休斯顿医学中心进修3月，以第一作者和通讯作者发表中英文文章20余篇；擅长呼吸系统感染和呼吸系统慢病如支气管哮喘和慢阻肺的诊治。国家远程医疗与互联网医学中心临床听诊专家委员会委员。

韩伟

中日友好医院 呼吸与危重症医学科PCCM学员，潍坊市第二人民医院呼吸与危重症医学科主治医师。

* 文章仅供医疗卫生相关从业者阅读参考

本文完

采写编辑：冬雪凝；责编：Jerry