对于下呼吸道感染或“肺炎”，最基本、最重要的是不遗余力地查找病原学，目前宏基因组在临床的应用非常广泛，它最基本的要求就是“标本合格”，合格后，会涉及到宏基因组检测的“临床判读”。我将从背景、报告参数、解读流程、临床解读难点以及tNGS/mNGS这个方面与大家一起学习。

一、背景

2019年，WHO全球卫生面临的10大挑战中，与感染性疾病相关高达6项；在2024年WHO世界卫生统计报告中，又提到了2021年全球前10位的死亡原因，其中有3个与感染相关，第二位是新冠、第四位是下呼吸道感染、第十位是结核（前10位还包括与呼吸道相关的慢阻肺病），因此，感染性疾病是人类健康主要威胁之一、“感染”是医疗卫生永恒的主题。

下呼吸道感染发病率、病死率高，这也是有依据证实的，根据2016年全球全年龄段下呼吸道感染死亡率分布地图，可见2016年，全球约3.36亿下呼吸道感染发病，237万患者因此死亡。

重症病房感染发生率高，死亡风险大

而在重症病房，这些生命垂危的患者感染发生率高、死亡风险大。2022年《JAMA》有一篇文章，研究者调查88个国家1150个医学中心的ICU，共纳入15202例患者，发现8135例可疑或证实感染，超过一半，其中确诊5419例（66.6%）、疑似1875例（23.1%）、可能789例（9.7%）。在感染类型方面，以革兰阴性菌为主（3540例，67.3%），其次是革兰阳性菌（1946例，37.0%）、真菌（864例，16.4%）和病毒（196例，3.7%）。

临床上的困境是什么？

感染性疾病诊断困难。因为病原种类多、涉及脏器系统多、患者症候群多、可能发生的场景多、宿主类型很多，这种情况下，我们会首先考虑患者的疾病是感染导致的吗？如果是，病原体是什么？针对该病原体的药物敏感谱是什么？做这些思考，才能取得最好的效果。

目前存在的诊断手段中，在形态学方面包括染色等，其阳性率低、不能定种；传统的分离培养与鉴定速度慢、阳性率很低，基层医院较低的检验科水平也会影响诊治；在免疫学检测方面，例如抗原检测，需要预设病原体，这就给诊断带来了许多困惑；在核酸检测方面，过去qPCR-Ct值可用于检测流感和新冠等疾病，但实际临床上，我们不一定能够做出“猜测”，病原体可能有非常多，因此核酸检测的二代测序即宏基因组学出现。因为它是无偏倚、高通量的测序方法，所以能够解决临床上许多问题。

感染性疾病核酸检测方法

如果形容感染性疾病核酸检测方法，PCR是“独杆钓鱼”，它是传统检测技术，只能覆盖少数常见病原，因为需要“基于已知”进行测序，其周转时间和实验时间较长，阳性率低，价格便宜。

在此基础上，metagenomic NGS类似“一网打尽”，共识推荐用于疑难危重症、新发突发等场景，虽然其广覆盖、无偏倚，但也存在不完美之处，如易受环境和背景微生物影响，如无法实现DNA和RNA共检，如果只进行DNA检测，势必导致漏掉非常多的RNA病毒，同时因为费用缘故无法大规模应用，而且宿主核酸易降低灵敏度。

因此，我们现在应用的较多的还有靶向富集重点病原的宏基因组学，即targeted NGS，它不受人源核酸干扰，灵敏度高，可以同时检测DNA和RNA，并且快速，14h-20h就可以得到结果。

宏基因组诊断改变了临床实践，从“预判-验证”到“无需预判”

2019年时，内蒙古-北京的鼠疫便为mNGS提供线索、CDC确诊；COVID-19早期预警方面，最初5名患者BALF RNA mNGS均鉴定出冠状病毒。回想曾经，2003年SARS鉴定耗时5月余，2013年H7N9鉴定耗时1月余，2019年SARS-COV-2鉴定耗时5天。现在它对临床的帮助非常大，但困惑也非常多。

二、报告参数

1、reads数：

reads为测序仪单个测序反应所得到的碱基序列，一般长度为50~75bp的片段；reads数是指测序获得的某种微生物属/种碱基序列的数量，与实验的总测序数据量直接相关。为避免总测序数据量高低的干扰，现在存在均一化序列数的概念：每一定的原始序列中（较好的实验室或测序单位往往以100K为例）含有该微生物的序列数，均一化序列数越高，则样本含有该微生物的检测信号越强。

图：每检测数据量为100K的序列，能在这100K的序列中，比对到48622条序列与肺炎支原体相匹配

2、覆盖率：

指达到给定深度的测序碱基占整个基因组或目标区域的百分比，覆盖率越高、越分散，通常表示检出该病原体的真实度越高。例如两个样本覆盖率分别为25%和95%，覆盖度达到95%的提示这可能是致病的病原学。

3、相对丰度：

指除去宿主序列之后，某微生物物种序列在相应大类物种（通常分成细菌、真菌、病毒、寄生虫4大类）中的分布比例，比例越高，说明该菌占比越高，致病相对可能性越大。

4、Q值：

指质量分值，用于衡量测序准确度。Q=-10log10P，其中P代表该碱基被测序错误的概率，Q20对应的测序错误概率为1%、准确率99%，Q30对应的测序错误概率为1‰、准确率 99.9%。我们拿到检测报告时可以看到质控信息，合格标准为Q20大于90%、Q30大于85%。下图中，Q30红框处意味着“所有检测碱基中：碱基错误检测概率为1‰的占比96.40%，高于要求的85%”。Q值越高，准确率越高，对实验技术要求越高。因此宏基因组的送选公司非常重要，目前行业内鱼龙混杂，临床医生应该格外注意。

三、解读流程

报告解读分为两部分，技术解读和临床解读。技术

解

读：检验科室如何出具报告？ 其中包括数据质控结果、同批次样本分析、病原体类型、生信比对结果、病原体报出逻辑，以及需要关注的一些问题： NGS检测质量控制如何？ 是否可能存在邻位强阳标本污染？ 检出病原体原始数据如何分析？ 原始数据多，遵循何种逻辑报告？ 临床解

读：医生如何解读报告？ 要针对临床症状、生化指标、针对性检测、影像学改变等等，需要考虑报告病原体是否和临床资料相符？ 报告需要关注哪些重点？ 结果是否对临床有意义？ 是否应该针对报告进行临床实践的更改？

大家一定都有共识，技术解读和临床解读之间一定要存在信息交流和沟通，临床经常遇到高度怀疑感染，但病原学反复没有阳性发现，在保证标本质量合格的情况下，我们必须与技术方交流沟通，甚至进行MDT，相辅相成、相互沟通才能真正解读好报告。

检测科室如何出具报告？

我们详细了解下检测科室如何出具报告，宏基因组的实验流程分为两部分，湿实验部分（实验室检测）和干实验部分（生物信息分析），实验室检测部分包括核酸提取、文库构建、上机测序；生物信息分析包括碱基识别、数据质控（去接头、去低质量碱基）、去除宿主核酸、参考数据库比对、种属鉴定、结果解读。

不同实验室病原体报告逻辑不尽相同，了解所在实验室报告逻辑有助于报告临床解读。

临床医生如何解读报告？

NGS检测结果用于 LRTI 病原学诊断时应遵循何种流程和路径？

我们在收到一份报告后，首先，需要分析报告质量判断结果可信程度，根据标本类型、报告形式及内容判断检测结果是否规范可信；

第二，检出微生物分级，需要判断是致病性微生物、条件致病微生物、定植微生物（致病性：肺内定植可能低，阳性多考虑感染；条件致病：需结合宿主因素，临床特点综合判断致病性；定植：引起 LRTI 的可能性低，多不考虑致病）；

第三，得出结果后，需要结合临床特征、微生物分级进行临床决策，如为致病性的病原体进行针对性治疗，如果是可能致病病原体，危重症患者需要调整抗感染方案+寻找其他证据支持，非危重症暂不调整方案+寻找其他证据支持。

第四，对于阴性结果的临床决策，需要区分“真阴性”还是“假阴性”。

如果经以上流程仍无法确认致病病原体，可组织MDT讨论，还要进行回顾性分析总结，积累临床经验。

宏基因组的报告信息 通常包括样本信息（患者情况、标本来源）、病原体检测结果以及补充列表，此外，还包括病原体解释、耐药和毒力基因检测以及质控信息。

1）报告质量：需要根据送检标本类型、报告形式及内容判断检测结果是否规范可信。高质量mNGS数据要求高质量序列reads数≥20M、Q30＞85%，举个例子，下图是不同研究脓毒症血浆游离DNA mNGS的阳性率和灵敏度，从中可见总序列数越多，阳性率越高，但灵敏度并非如此。

2）微生物分级：

定植还是致病？微生物分级有助于区分，临床医生需要根据报告和临床资料把握致病病原体。

有些单位频繁进行宏基因组检测，患者的临床症状可能已经完全改善，仍然培养出鲍曼，因此继续用药。但这时，既然感染已经控制，就不能再仅根据病原学来进行评判。

对于检出微生物致病性分级，《中华结核和呼吸杂志》发布的“下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识”有很大帮助，根据微生物在下呼吸道的致病性特征，初步分为致病性微生物、条件致病微生物、定植微生物。

条件致病微生物致病性的评判难度更大，应根据宿主因素、影像学特征、抗感染药物用药史、治疗反应、传统微生物学检测综合判断，呼吸科医生在这方面非常具有优势。

3）临床决策：该共识还提到结合临床特征、微生物分级进行临床决策，对于“阳性结果”，如为致病病原体，则针对性治疗，如可能致病病原体，危重症患者调整抗感染方案+寻找其他证据支持，非危重症患者暂不调整方案、寻找其他证据支持，必要时MDT；对于“阴性结果”，如怀疑感染，则分析背景微生物、结合其他检测，必要时MDT，如非感染疾病，治疗原发病会得到很好的结果。

4）多学科会诊（MDT）与经验总结：

mNGS检测涉及多个学科专业知识，针对疑难LRTI病例的报告解读，应该组织MDT，MDT应该纳入呼吸与危重症、感染、临床微生物、临床药学等专业人员共同参与，必要时纳入熟悉mNGS试验流程的生信和技术人员参加。病例完成，应进行临床经验总结。

四、临床解读难点

如何对mNGS检测报告的微生物进行致病概率分级？

mNGS 检测结果的解读必须结合常规微生物实验室检测，包括涂片和培养、特殊染色，以及各种分子生物学检测如抗原抗体、PCR、G、GM试验等。

我们曾经遇到过一种情况：患者存在一个拷贝数的结核分枝杆菌，多次X-pert均为阴性，临床症状也不够符合，这时就可持否定态度了，因此提示我们必须结合一些分子生物学检测方法。

辅助 LRTI 判断推测感染病原体常见项目包括血常规、降钙素原 、C反应蛋白、红细胞沉降率等；怀疑非感染性疾病时，鉴别诊断应包括肿瘤标记物、自身抗体谱、免疫球蛋白、补体等；另外，不同病原体LRTI有不同的特点，实变、结节伴空洞、弥漫性磨玻璃改变等考虑方向不同。

如何根据mNGS阴性报告作出临床决策？

大家碰到的mNGS阴性情况越来越多，有可能是“真阴性”，为非感染性疾病：非感染性炎症如结节病、自身免疫性疾病等；肿瘤性疾病；内分泌疾病可有类似肺部感染表现。

还有可能为“假阴性”，有可能是因为：1）特殊病原体难以检出，对于某些病原微生物，如胞内菌、结核分枝杆菌、真菌，考虑mNGS检测灵敏度较低，阴性预测性差，并不一定优于常规检测方案。2）标本/项目选择不正确，例如mNGS会漏掉RNA病毒等，另外胸水并非是很好的标本，因为人源干扰非常多，最好的下呼吸道感染标本是支气管肺泡灌洗液。3）低于检测限：用药有效微生物被抑制或杀死，或病毒核酸载量低，低于报告阈值。这时，需要我们查原始数据，针对性加做怀疑病原体检测——tNGS，PCR。4）关注补充微生物列表：如果实验室不明确是否致病，那么我们可将污染/背景可能性/序列数低列入补充列表。

总之，当回报阴性结果，临床医生应结合病史及疾病演变、影像及其他病原体检测手段综合判断，必要时送检不同部位标本如BALF、血、肺组织等，动态评估抗感染效果。在这种“感染”面前，呼吸科医生的临床思维非常优秀、全面。

案例分析：一位55岁男性，标本类型为“全血”，症状表现为发热、寒战、咳嗽伴咳白痰10天，血象不高，但血小板下降、降钙素原高。全血mNGS结果：EBV（序列数：5）；庚型肝炎病毒（序列数：2505），其他常规结果：骨髓培养阴性杆菌；布鲁菌病抗体阳性；血培养布鲁菌属，而且这位患者还有流行病学史。最终虽然宏基因组为阴性，但是临床仍然诊断为布鲁氏菌病。

提示大家，宏基因组无法替代传统病原学诊断技术，应用常规技术检测的同时，或在其基础上开展mNGS，必须同时监测，不能“孤注一掷”。

mNGS 报告中出现多种病原微生物如何解读？

推荐多种检测技术交叉验证，明确主要致病微生物。“假阳性”可能是标本质量不合格，或标本采集、送检过程受呼吸道定植菌、皮肤定植菌、环境菌、工程菌的污染，或检测过程中背景菌的质量控制不严格，以上是污染的情况，也有可能是与临床不符——患者的职业和生活环境、基础疾病、临床特点和影像特征与检出的微生物不相符，或无法用其他微生物学方法验证；或治疗反应和疾病转归与检出的微生物不相符。

另一种情况是“真阳性”，出现了混合感染，例如误吸，对于误吸风险或明确误吸史的患者，如果出现多种常见口腔定植菌，则需考虑吸入性肺炎/肺脓肿。此类病例常可同时在下呼吸道标本涂片和(或)培养中检出相应的混杂菌群。另外，CAP患者有时会出现细菌、非典型病原体、呼吸道病毒等混合感染。大家还特别清楚，免疫缺陷宿主LRTI常发生细菌、真菌、病毒、分枝杆菌等病原微生物的混合感染。

标本类型对解读mNGS报告有什么影响？

对呼吸道常见mNGS检测样本进行分类解析，确保临床易用性。

1）痰（包括诱导痰）、气管吸引物、BALF及各种经支气管镜肺活检标本：易受口腔或上呼吸道常见定植微生物的污染；BALF标本中致病微生物的载量通常较高，受非致病微生物和人源核酸的干扰较小；肺活检标本的阴性结果并不能排除感染。

2）胸腔积液与肺组织标本：经皮穿刺标本易受皮肤定植微生物或环境微生物污染；如mNGS 送检标本为大块的外科手术活检或切除标本，如呈阴性结果，基本可以作为排除感染的重要依据；脓胸中虽然致病微生物的载量较高，但也同时存在大量的炎症细胞，人源核酸占比高，去人源核酸操作可能导致结果呈假阴性，结果未必使我们满意，因此脓胸未必能培养出病原学。

3）血液：血液检出致病微生物序列，不代表该病原微生物来自呼吸道，大家也许经常遇到血液标本检出CMV、EB病毒等DNA病毒，这时是否存在病毒性肺炎，需要结合临床表现、肺部影像表现和下呼吸道标本的检测结果综合判断；血液标本结果受人源核酸的干扰较大；血浆微生物mNGS可能导致某些胞内致病微生物感染出现假阴性。

4）mNGS报告中低 reads 数微生物如何解读？需要从以下几个方面考虑：某些病原微生物的核酸提取效率低和（或）标本中该病原载量较低；采样、运输和实验过程中引入污染可能，结合临床分析之后，若考虑此低 reads 微生物不是致病微生物，应考虑污染或者假阳性结果；生信分析中出现假阳性结果。

最终，临床医生应结合患者临床表现、影像学、常规微生物学检测结果，综合判断该低 reads病原微生物的临床价值。如果怀疑此微生物感染，条件允许时采用其他方法验证。对于难以确定临床意义的低序列数微生物，必要时可进行MDT讨论。

案例分析：患者女性，52岁，标本类型为BALF，阵发性咳嗽、咳痰3周余，伴有低烧，双肺多发实变磨玻璃密度影，考虑感染性病变。血常规、CRP、PCT、ANCA相关抗体、G、GM试验阴性。虽然我们在临床上考虑为感染，但治疗效果不佳，完善纤支镜，BALF mNGS结果：烟曲霉 （序列数 2）。

这时需结合其他临床特征综合分析：是因为曲霉属于厚壁微生物，mNGS检测易出现假阴性吗？本例患者中年女性，无免疫功能低下相关的宿主因素，临床表现不符合肺曲霉病，在微生物学证据方面，患者BALF和血标本的GM均为阴性……证据不足以诊断肺曲霉菌病。

最终行经皮肺穿刺活检，肺组织未检出曲霉，同时病理结果报告符合机化性肺炎。因此修正诊断为隐源性机化性肺炎（COP），给予激素治疗后，病变吸收。

LRTI病原诊断中耐药基因、毒力基因意义如何？

目前我们仍然跟随传统培养的敏感和耐药进行临床工作，共识中特别强调，mNGS可提供耐药与毒力基因，但受限于序列读长和测序深度，尚有一定局限性。

五、tNGS/mNGS

目前因为费用、检测时效等原因也常常推荐tNGS，其相较于mNGS有何差异？tNGS原理是针对目标病原微生物基因序列，设计特异性引物，采用超多重PCR建库体系，对目标序列进行靶向扩增富集。

因此它与mNGS相比，优势是检测时间缩短、敏感度与特异度更好无需检测人源序列，检测成本下降，劣势是病原谱比mNGS“窄”，无法检测未知病原微生物。

而反过来，mNGS与tNGS相比，理论上可检测数据库中所有微生物，可检出新发、未知、罕见病原微生物，但劣势是检测结果临床解释有一定难度，容易受到人源核酸干扰，易受环境微生物、定植微生物干扰，检测成本高。

因此，总体来说，tNGS受环境、定植微生物干扰少，低序列检出情况少，报告解读相对更容易，可以借鉴mNGS报告解读的流程方法。但对于阴性结果，应考虑病原谱原因。

总结

NGS是危重症患者寻找寻找病原学证据的重要方法，我们应该了解NGS的reads、reads数、覆盖率、相对丰值和Q值等参数意义，报告应当按照流程解读，建议为“分析报告质量→对报告微生物分级→结合临床做出决策（阴性结果解读）→必要时MDT→经验总结”。

临床分析的难点主要是微生物致病概率分级、标本类型的选择和解读、低reads微生物检出意义、耐药与毒力基因的解读。

在tNGS报告解读方面，可借鉴mNGS报告解读经验，阴性结果需考虑病原谱。

参考文献

[1] WHO世界卫生统计报告，2024

[2] Lancet Infect Dis,2018,18(11):1 

[3] JAMA, 2020,323(15):1478-1487. 

[4] Gu W et al. Annu Rev Pathol-Mech. 2019. 14(1), 319

[5] 下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识. 中华结核和呼吸杂志, 2023, 46(4):322-335.

专家简介

罗红

教授，一级主任医师，博士生导师；中南大学湘雅二医院呼吸与危重症医学科主任、危重症亚专科主任；中华医学会呼吸病学分会呼吸危重症学组委员；中国医师协会内科医师分会委员；中国医师协会呼吸医师分会危重症医学工作委员会副主任委员；中国残疾人康复协会肺康复专委会常委兼ICU肺康复学组副组长；湖南省医师协会呼吸医师分会会长；湖南省医学会呼吸病学专业委员会副主任委员。

本文由《呼吸界》编辑 Jerry 整理，感谢罗红教授的审阅修改！

* 文章仅供医疗卫生相关从业者阅读参考

本文完

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