中国ST11-碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌亚克隆替换与一种重组酶recC点突变相关
来源: 京港感染论坛 2023-08-27


2023年4月28日,来自深圳市人民医院呼吸疾病研究所的周凯教授(第一作者、通讯作者)和来自浙江大学医学院附属第一医院的肖永红教授共同通讯在Nature Communications杂志上发表题为「A point mutation in recC associated with subclonal replacement of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae ST11 in China」的研究论文。该研究通过多中心菌株收集和基因组信息分析,在血流感染来源的、碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌(CRKP)优势克隆ST11中发现了O2v1:KL64取代OL101:KL47的优势亚克隆替换,并且发现O2v1:KL64的扩张与在具有进化优势的亚克隆中聚集的一系列基因组改变相关。


肺炎克雷伯菌是重要的医院内致病菌,近年来碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌(CRKP)在全球范围内呈上升趋势,并与巨大的全球公共卫生负担相关。CRKP的种群结构因地理位置而异,在我国,目前最流行的克隆为ST11型CRKP。此前,作者在一项单中心的研究中观察到ST11-CRKP血流感染分离株存在亚克隆替换,原来流行的ST11-KL47逐渐被ST11-KL64取代,潜在的进化驱动因素尚不清楚。


一、克隆替换与重组有关


该研究利用2014 - 2019年全国血流分离株监测框架采集的794株CRKP- ST11,对其基因组进化进行了分析,明确了从2014到2019年,中国ST11群体发生了OL101:KL47(KL47)到O2v1:KL64(KL64)的亚克隆替换(图1)。通过对菌株进行系统发育分析,表明KL64是从KL47进化而来的(图2),而这种进化似乎与重组密切相关。在KL64中,r/m比值更高以及分支出来的血清型更多,由此推测在KL64存在更强的重组能力(图2)。作者检测了与重组相关的亚克隆特异性SNPs,发现相对于KL47,recC基因点突变(2804A >G; His935Arg)仅在KL64中存在。作者设计了一个KL64突变体(KP37485ΔrecC),通过对DNA损伤剂丝裂霉素C的抗性实验,证实了recC的缺失确实消除了菌株重组能力,这可以通过与recC O2v1:KL64或recC OL101:KL47互补来恢复(图3)。作者还通过用recC OL101:KL47替换recC O2v1:KL64,构建了一个等位基因突变体KP37485-recCOL101:KL47。与KP37485相比,KP37485- recCOL101:KL47对丝裂霉素C的抗性降低了3倍;KP37485的重组频率比KP37485- recCOL101:KL47高245倍。而KP37485ΔrecC中未检测到同源重组。结果表明,recC基因的单一错义突变可显著提高重组能力。


图1. 2014年到2019年ST11-CRKP中OL101:KL47和O2v1:KL64菌株比例变化。


图2. 646株CRKP-ST11分离株的系统发育分析


图3. recC介导对丝裂霉素C耐受


二、获得rmpA阳性毒力质粒推动了O2v1:KL64的扩张


对KL47和KL64菌株携带的毒力因子进行分析,发现KL64携带的毒力决定因子明显多于KL47,且携带rmpACD和rmpA2比例也更高。以rmpA/A2阳性分离株为hvKP,发现KL64-hvKP 在KL64 和CRKP-ST11中的比例分别从2014年的0%到2019年的85.9%和69.9%,表明KL64的扩张与hvKP种群规模的增加有关。将ST11CRKP的序列与作者此前发现的毒力质粒进行比对,发现大多数rmpA/A2阳性菌株具有毒力质粒。通过比较KL47和KL64的基因组系统发育位置和质粒序列相似性,发现KL47和KL64的毒力质粒在水平和垂直方向上都有传播。根据rmpA/A2的存在情况对两种菌株进行分组,与没有毒力质粒的菌株相比,两个亚克隆的rmpA/A2阳性菌株更加抵抗巨噬细胞吞噬作用,但仅在KL64中具有显著性(图4)。


图4. 比较具有w/o毒力质粒的菌株的巨噬细胞吞噬抗性(以rmpA/A2存在与否标记)


三、抗生素四环素和磺胺甲恶唑-甲氧苄氨嘧啶可能参与了优势克隆的选择


为了探究抗生素是否参与亚克隆的选择,作者对两种亚克隆的抗生素耐药基因进行分析。oqxAB在KL47中显著升高,而在KL64中,blaLAP-2、dfr -like、qnr -like、sul -like和tet(A)显著升高。在KL64中,这些ARGs和rmpA/A2的存在有很强的相关性,且KL64-hvKP群体对四环素和磺胺甲恶唑-甲氧苄啶的耐药率最高(图5)。


对至少携带两种以上耐药基因的17株菌进行长读测序,发现携带这些耐药基因的质粒被划分为3种Inc类型(IncFII、IncFII- fIB和IncFII- R),其中以IncFII为主(13/ 18)。将这些质粒序列与两种亚克隆基因组序列进行比较,发现IncFII型质粒在KL64中普遍存在,尤其是在KL64- hvKP中,但在KL47中较为罕见。基于毒力和耐药基因的各种组合,总共检测了48种基因型。最常见的基因型(基因型1和基因型2)编码除dfr -like和/或oqxAB外的所有基因,占KL64基因型的47.9%(202/422),2014年至2019年,这两种基因型的比例从0%显著增加到64.7%(119/184),表明这两种基因型可能是导致克隆优势的、成功的基因型。相比之下,基因型3和4不携带任何目标基因或仅编码oqxAB,它们在种群中的比例从峰值下降(从2015年的63%(17/27))到2019年的4.9%(9/184)(图6)。


图5. A. OL101:KL47和O2v1:KL64 w/o毒力质粒中ARGs分布差异显著。比较与这些arg相关的药物(环丙沙星、四环素和磺胺甲恶唑-甲氧苄氨嘧啶)的耐药率;B. 在OL101:KL47(n =192)和O2v1:KL64 (n = 422)中,与毒力质粒相关的ARGs。


图6. 2014 - 2019年O2v1:KL64基因型随时间变化趋势


四、医院间传播的增强促进了O2v1:KL64-hvKP的传播


作者根据每年的成对SNP距离来区分可能的近期传播事件。根据收集的突变率和参考基因组长度以及最近的区域流行病学研究,作者将SNP阈值设定为14-25个SNP。对于KL64,医院内近期传播的比例从(100-89.7%)急剧下降到(71.5-40.9%),而医院间传播的比例从(0-10.3%)急剧上升到(28.5-59.1%), 在KL64-hvKP种群中也观察到类似的传播动力学。表明高毒亚群通过加强医院间传播促进了KL64的传播。2014 - 2019年,KL47在医院内([100-98.6%]-[100-83.3%])和医院间([0-1.4%]-[0-16.7%])的近期传播比例相对稳定,表明K47的传播模式随时间没有显著变化。(图7)


图7. 2014-2019年OL101:KL47和O2V1:KL64的时间传播动力学


五、ST11亚克隆的起源


通过系统发生地理学和分子钟分析发现,O2v1:KL64在中国约公元2006年从OL101:KL47衍生出来(95% HPD AD 2004–2009),而OL101:KL47则在公元2005年(95% HPD AD 2002-2008)左右出现。全球和中国分离株最近的共同祖先可追溯到公元1983年(95% HPD AD 1977-1989)。


总而言之,作者在优势克隆ST11-CRKP中发现了亚克隆替换事件,之前普遍存在的亚克隆OL101:KL47随着时间的推移逐步被O2v1:KL64取代。O2v1:KL64携带更多的移动遗传元件,并且O2v1:KL64的recC中检测到的特异的点突变显著提高了重组能力。O2v1:KL64的流行成功进一步与对吞噬作用、磺胺甲恶唑-甲氧苄氨嘧啶和四环素耐药性增强的高毒亚群有关。表型改变与分别获得rmpA阳性的pLVPK-like毒力质粒和IncFII型多药耐药质粒所赋予的高毒力因素和抗生素基因的过度表达有关。更频繁的医院间传播进一步促进了优势亚克隆的传播。


译者简介



张安汝


北京大学医学部 临床检验诊断学 博士研究生,导师:王辉教授。


译者:张安汝(北京大学医学部);审校:王启(北京大学人民医院)


本文转载自订阅号「京港感染论坛」(ID:PIDMIC)

原链接戳:【CRE专栏】中国ST11-CRKP亚克隆替换与一种重组酶recC点突变相关


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本文完

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