肺部感染病原学诊断现状如何？世界范围内，呼吸道感染在成人及儿童的发病率及致死率中居于第二位，在全球疾病负担排名中跃居榜眼。

现在肺部感染的病原诊断里，很多病原学都搞不清楚，这是一个大的问题。

因为肺部感染病原体构成复杂，有细菌性肺炎、病毒性肺炎、真菌性肺炎、支原体肺炎等等，如果能查出来40%都是阳性，水平就已经很高了，按国际顶级杂志的说法，能将40～50%的肺部感染搞清楚病原，就属于高水平，剩下的还有很多都搞不清。困难不仅是这些，新的病原体也层出不穷，病原微生物中超过70%的病毒都来源于动物传播，而自然界超过99%的微生物尚未明确！之前的SARS、H5N1、H1N1、MERS、H7N9、H10N8、Ebola、H5N6、Zika等等都是我们大家经历过的。

在场的参会人员的多以肺部感染为主，在肺部感染里有个特殊的地方，就是上呼吸道的「污染」。通过内镜、经皮肺穿刺来获取组织标本是诊断肺部感染的有效手段，但是这部分存在的问题很大，且没有很好的引起重视；另外，血液、胸腔积液这种从无菌部位采取的标本，很多人也不把它当回事情，而是只认为痰有用，但没有想到痰以外其他标本可能更有用。也就是说，呼吸道样本采样难、易污染、甄别难！假阳性、假阴性率较高，导致误诊或贻误治疗：

现在很多临床医生都习惯于责怪检验科，说检验科搞了半天、我也送了很多标本，为什么一个标本都没给我们提供阳性的诊断依据？然后实验室的人就不得以「背了黑锅」，但其实，微生物室的误差70%是实验前因素造成的，病原微生物送检是感染控制的基础！其实很好理解，如果我们的标本不合格、采集的不是感染部位、保存和送检的方式也不对，出来的结果怎么会正确呢？临床采样标本的质量管理，避免实验室「假情报」，是我们未来的重点。

感染性疾病病原学检测方法

传统的病原体检测技术主要是基于微生物培养和分离，方法包括涂片镜检、标本分离培养、生物化学试验以及常规的血清学试验等。目前病原体检测的主流发展趋势是基于分子遗传水平的核酸检测技术，与传统检测方法相比，显著提高了病原检测的敏感度，缩短了检测时间。目前，临床上以多重PCR 、基因芯片以及高通量测序技术（Next Generation Sequencing, NGS）为当前研究应用的热门方向。

传统技术和mNGS的比较

传统病原检测金标准：病原体分离培养鉴定：

当患者的状况十分危重，检验科又告诉你「什么都没长」——培养基里什么也没有，不少人就要慌了，当传统病原检测流程复杂、周期漫长、检测种类有限、阳性率低时，该如何解决临床上病人微生物的诊断？

我们现在需要有一个快速诊断的技术，包括多重PCR、基因芯片、高通量测序、宏基因组学、mNGS等方法。传统的方法其实存在很多的缺陷。新的方法中，基因检测、宏基因组学的NGS可以「一站式解决」，时间比较短、不会出现漏掉，但是信息量太大，要从大量的信息中找出来哪个是元凶，这是也是需要水平的，否则把正常的定植菌当成感染菌、把人体细胞的正常背景菌当成致病菌，那就出问题了。

2012 Nature Reviews 高通量测序变革临床微生物检测：

我们今天要讲的是传统病原学的优点和缺点、宏基因组学的优点和缺点

高通量病原检测技术（mNGS）

NGS是Next Generation Sequencing，是通过并行测序的方法，一次对几十万到几百万条DNA进行序列测定。（宏基因组测序是metagenomics NGS）。

为了了解新技术，我们来看一份是华大基因的检测报告：

其中能看到属、种、检出的序列数，给大家进行下解读：

覆盖率中，0.14和0.15很接近，0.0029基本可以忽略。相对丰度也很重要，就是说，它在种或者属的水平上，检测到的该微生物在整个样本中检测到的相同类型微生物中所占的比重是多少，抛掉这个0.58，我们看到有31、27，然后再看唯一比对上某物种（属）的序列数。

如果从这份报表上来看，我们更多要考虑铜绿假单胞菌是可能致病病原体。

小总结：报告解读

Unique reads推荐阈值：一般的病原体（细菌/支原体/衣原体/结核/病毒/真菌），3～5个就有意义，但是寄生虫、原虫要超过一百，否则没有意义。

Reads数很重要，但非唯一指标：Reads数高，但coverage过低的不考虑（<1%），致病菌往往也是优势菌，相对丰度（Re_Alu）低的不考虑。

质量控制很重要：有人说，拿到手的都是唾液！这也是没有意义的，因为人源序列>90%，标本就要考虑采样或抽提不合格，等同于吐了口水，就想做下呼吸道感染的、肺部感染的标本，这不是自己骗自己吗？如果低质量序列过多（Q30 < 80%）就要考虑测序质量不佳，就不应该去做测序。

NGS病例分享

这里有几个病例，我们来客观看下

病例1

传统方法 Lose v.s. NGS Win

患者女，65岁。

主诉：反复高热1周，伴恶心呕吐腹泻，尿频尿急尿痛。

外院头孢曲松抗炎效果不佳，既往乳腺癌靶向治疗史。

入院体征：T:39.3; P:144; B:38; BP 112/66;

体格检查：双肺呼吸音粗，未及干湿啰音

实验室检查：WBC:5.08*10^9/L；NEU% 86.9↑%；LYM % 10.9↓％；MON↓% 2.1％; HB 91↓g/L；CRP: 131 ↑ ；ALT80↑IU/L；AST195↑IU/L

侵袭性、增值性的两肺实变病灶，入院后迅速进展为重症肺炎+ARDS，常规微生物学检查：送检血清、痰和胸水标本，细菌和真菌培养阴性；G实验、GM实验阴性；HIV、HBV、流感病毒、SARS及其他冠状病毒均阴性（ELISA、(RT)-PCR）

下一步怎么办？我们来看看诊治经过：

从山重水尽疑无路，到柳暗花明又一村，NGS助力揪出了元凶——军团菌。

有人问，为啥不是肠球菌呢？是因为肠球菌一般不会造成肺部感染，其他这些都是正常的背景菌，或者定植菌，那我们就也不考虑了，搞清楚病原后，按照军团菌进行治疗。患者的病灶得到了明显吸收，逐渐好转。且看以下对比：

病例2

传统方法 Lose v.s. NGS Win

中年男性，55岁，弥漫大B细胞淋巴瘤患者CHOP方案化疗后10天出现肺部感染，「泰能+大扶康」抗感染治疗效果欠佳。

迅速进展为重症肺炎，呼吸衰竭、两肺弥漫性病变，调整为「头孢哌酮舒巴坦+卡泊芬净+更昔洛韦+甲泼尼龙+复方磺胺甲噁唑」方案：

进行了血NGS检测，明确为耶氏肺孢子虫感染，然后增大复方磺胺甲噁唑剂量，停用卡泊芬净、更昔洛韦，患者好转。

小总结

病原体检测是肺部感染精准治疗的基础，相较传统病原体检测技术，NGS可有效提高阳性率，NGS在鉴定疑难感染病原及非典型病原体方面具有重要的临床应用价值！

病例3

传统方法Win v.s. NGS:Win

患者， 男，53岁。

主诉：检查示肺部阴影2周余，无咳嗽、咳痰、气促、发热等不适（神经内科诊治帕金森病期间）

既往史：初诊帕金森，尚未用药。糖尿病史2年余，未规律用药，空腹10mmol/L左右。2003年诊断AML（M3）病史（2003-2008年使用砷剂化疗，复查无殊）。

个人史：吸烟10余年，每日2包，已戒烟10年。

辅助检查：

2017-11-13 胸部CT：双肺多发结节，拟转移瘤可能；左肺上叶斑片影伴小空洞,考虑原发CA，建议活检；双侧胸腔少量积液。

2017-11-15 PET-CT：1、左肺上叶尖后段斑片影，代谢增高，双肺多发结节，部分代谢增高，首先考虑炎性病变，恶性病变不能除外，建议病理学检查。2、肝右叶钙化灶。3、双侧肾上腺增粗，左侧肾上腺小结节，代谢不高。4、左侧肾盂输尿管上段扩张积水；双肾结石；右肾囊肿。5、脊柱退行性变。6、全身其余部位目前未见明显异常高代谢病灶。

2017-11-27 CT引导下肺穿刺 （病理）：肺泡上皮无异型，局灶见类上皮细胞及多核巨细胞增生，未见干酪样坏死，间质纤维组织增生，较多淋巴细胞及浆细胞浸润。

主要化验：血常规（-）肿瘤标志物（-）乳胶凝集试验（-）G试验（-）T-spot（-）痰培养：细菌（-）、真菌（-）

从影像上可以看到两上肺多发性结节病灶、低密度影。想到的常见疾病，结核肯定是不能少。

入院诊断

1、肺真菌感染？ 

2、帕金森病 

3、糖尿病 

4、白血病个人史

入院后完善检查：2017-12-13行支气管镜检查， BALF：涂片找见抗酸杆菌 （7条/300个视野↑）；T-SPOT：（+）（A/B 41↑/ 92↑）；结核杆菌培养（+）

毫无疑问，这个病人果真是结核。我们看看NGS结果：和传统方法互为印证。

小总结

病原体检测是肺部感染精准治疗的基础，传统病原检测涵盖临床常见病原菌，具有一定的靶向性，阳性预测价值大，是目前感染病原检测的金标准！NGS无靶标测定标本中所有微生物，灵敏度高，阴性预测价值大。两种方法互为补充、平行送检可有效提高检出率！

还有一种情况，传统血清型方法有效，但NGS是失败的。

病例4

传统血清学方法 Win v.s. NGS Lose

患者，女性，25岁。

主诉：咳嗽、咳痰两月。

现病史：患者两月前无明显诱因下出现咳嗽，咳痰，起初痰量不多，为白色黏痰，可咳出。后咳嗽逐渐加重，近两日出现痰中带血，量不多，色鲜红，病程中，无明显发热、盗汗、胸闷、胸痛、气促等不适。门诊拟诊肺部阴影收治入科。

既往史：既往体健。

查体（-）。

入院后完善检查：

胸部CT：右肺中上叶斑片状渗出影，病灶密度不均匀。

气管镜：右上叶支气管可见白色坏死样物质

多次痰检及支气管毛刷涂片未找见抗酸杆菌；痰培养（-）

T-SPOT阳性

从临床医生的角度，作为一个临床医生，不可能把结核忘掉。但很遗憾，NGS未报告分枝杆菌。

诊断

肺干酪性结核，痰培养（-）

进行抗结核治疗，明显的吸收好转。

还有一种结果，传统方法和NGS都没用。

病例5

传统方法Lose v.s. NGS:Lose

患者，男性，23岁；

主诉：反复咳嗽咯血5月；

外院间断抗感染+止血治疗后症状反复，为明确诊治入院。

既往体健，无慢性疾病及传染病病史。

入院体征：T:36.6；P:110；B:20；BP 135/82;

查体：（-）

诊治经过：

经验性治疗无效、NGS结果给了我们「假情报」。

看到这个结果，医生很高兴，认为是确定了是这种感染，很奇怪，这位患者是从血里头测出来的结果，有人说「血里测出来的不可能是污染」！而且追问病史时得知这个患者曾去日本旅游，到了岛上很兴奋，摔了一跤，树枝把皮肤擦破出血了，何况又在血里找到了卟啉单胞菌，就顺理成章地认为是感染！给患者进行了治疗，但没有用处。

最后按照真菌治疗，才「巧合」的恢复了。其实这位患者到日本去旅游，跟他发病没啥关系。

真菌的治疗前后对比：

2018年2月9日胸部CT：

2018年4月3日胸部CT：

2018年4月26日胸部CT：

2018年5月30日胸部CT：

小总结

尽信书不如无书！Each of the major achievements will bring new problems！——Albert Einstein。任何的检测技术均应结合流行病学、临床特征等综合分析，去伪存真，确定其是否为真正致病菌！

总结

在进行mNGS结果的解读时，要注意致病菌/污染/定植（背景菌）这些关系，而且，结果可能与传统方法结果一致，均为阳性或均为阴性；也可能与传统方法结果不一致，传统方法阳性，mNGS阴性，或传统方法阴性，mNGS阳性。

mNGS中也存在着一些问题，例如以下几种，人源污染：要开发新的高效的抽提试剂；来规范无菌采样工作；背景菌污染：采样、送检、实验操作要保持无菌；如果有可能要设立阴性对照；复杂的组学研究分析方法的差异：需要推进微生物组研究实验和分析方法的规范化、标准化。

对此，中华医学会呼吸病学分会感染学组在2018年出的指南已经写的很明确：

最后强调mNGS的应用

临床标本送检：平行送检/补充手段：当传统方法难以检出或区分的病原微生物时，遇到疑难或重症感染患者、怀疑特殊病原体或新发病原体感染者、免疫抑制患者感染时，考虑mNGS；

临床解读：要结合临床、流行病学等综合分析，去伪存真；

科研价值：注意新型病原体发现，耐药等表型鉴定，微生物群落分析等。

专家介绍

瞿介明

主任医师，医学博士，博士和博士后导师，上海交通大学医学院附属瑞金医院院长，呼吸内科教授，上海市领军人才。中华医学会呼吸病学分会侯任主任委员，中国医师协会呼吸医师分会副会长，中华医学会呼吸病学分会感染学组组长，上海市呼吸病学主任委员，上海市呼吸病研究所常务副所长。