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摘要
遗传性肺泡蛋白沉积症（hPAP）是一种罕见的间质性肺疾病，由CSF2RA或CSF2RB突变引起，其特征为肺泡巨噬细胞功能失衡引起表面活性物质沉积。全肺灌洗治疗可有效缓解症状，但具有一定风险。细胞治疗是一种新型治疗方法，已在hPAP治疗中取得进展，为hPAP的治疗提供了新的治疗策略。
肺泡蛋白沉积症（pulmonary alveolar proteinosis，PAP）是一种罕见的间质性肺疾病［1］。该病发病率约7/1 000 000，其特征是不同原因引起的肺泡巨噬细胞功能异常，导致肺泡表面活性物质（surfactant，SF）在肺内大量沉积，引起气体交换障碍，出现咳嗽、呼吸困难等症状。根据已知的发病机制，可分为原发性PAP、继发性PAP和先天性PAP。原发性PAP是目前发病率最高的PAP类型，其进一步分为以自身粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）抗体增多为特征的自身免疫性PAP（autoimmune PAP，aPAP）和以编码GM-CSF受体CSF2RA或CSF2RB突变为特征的遗传性PAP（hereditary PAP，hPAP）［2］。针对不同类型的PAP患者，目前主要的治疗方案包括全肺灌洗（whole lung lavage，WLL）和GM-CSF治疗等。WLL疗效较为确切，可适用于所有PAP类型，但患者需全身麻醉插管，并且有发生术后并发症的风险［3］；GM-CSF主要用于aPAP患者，但国内目前以aPAP为适应证的GM-CSF药物较少［4, 5］。近些年，利妥昔单抗治疗、血浆置换治疗和调脂治疗等方法也在进行临床评价，但样本量较小［6］。肺移植也是治疗PAP的手段之一，主要针对PAP伴广泛纤维化和肺动脉高压的患者，但是肺移植风险和成本均较高。因此，目前PAP的治疗尚无安全、有效的治疗方案，探索新的治疗策略意义重大。
细胞治疗是将不同的功能细胞输入患者体内，执行相关细胞功能，或调控局部微环境，促进内源性再生，达到改善或重建细胞或组织功能的一种疗法。目前，诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）、骨髓或脐血来源干细胞和（肺泡）巨噬细胞移植治疗在hPAP中的应用取得了进展［7］，本文就细胞治疗在hPAP的临床前研究及临床研究进行综述。
一、细胞治疗hPAP的理论依据
GM-CSF信号在肺泡巨噬细胞分化、成熟和执行功能中起重要作用，其信号功能异常导致肺泡巨噬细胞清除蛋白质和磷脂的能力受损，从而引起SF肺内沉积。因此，如何改善功能缺陷的肺泡巨噬细胞是治疗PAP的核心目的。因此，可以通过替代或修复功能损伤的肺泡巨噬细胞，达到治疗PAP的目的。
二、细胞治疗hPAP的临床前研究
目前，研究较多的PAP类别是hPAP，其细胞治疗的核心是外源性补充具备正常功能的肺泡巨噬细胞。Csf2ra-/-和Csf2rb-/-小鼠是研究hPAP的重要工具，通过敲除Csf2ra或Csf2rb使小鼠肺泡巨噬细胞受体的α链或β链表达异常，从而产生与hPAP患者相同的疾病表型［8, 9］。因此，用于治疗PAP的巨噬细胞可根据来源分为骨髓或脐血来源（干）细胞、（肺泡）巨噬细胞和iPSC。并根据治疗方式不同，可分为骨髓移植（bone marrow transplantation，BMT）和肺内巨噬细胞移植（pulmonary macrophage transplantation，PMT）2种方法［10, 11, 12］。
1. 骨髓或脐血来源（干）细胞：肺泡巨噬细胞最初被认为是来源于血液的单核细胞，迁移到肺泡内分化而成，而单核细胞群体来自骨髓内的髓系祖细胞［13, 14］。虽然后来很多研究重新定义了肺泡巨噬细胞的来源［15, 16］，重建髓系造血更新肺泡巨噬细胞仍然是干细胞治疗hPAP的重要思路，并获得了成功。
Murray课题组最先将BMT引入hPAP的治疗。Csf2ra-/-小鼠经放射清髓后，经静脉输注野生型小鼠（C57BL/6）的骨髓细胞。接受了野生型小鼠骨髓细胞移植的Csf2ra-/-小鼠肺泡腔内的沉积物较前明显减少，支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中蛋白含量也有所减少［17］。这项研究是在认识hPAP机制之后对其治疗的首次尝试，为之后的研究奠定了基础。
Moritz课题组利用BMT的思路，结合基因编辑技术，对该疗法进行了更为深入的探索。用γ-反转录病毒将小鼠Csf2ra基因转入Csf2ra-/-小鼠的骨髓细胞，12周后，经过治疗的Csf2ra-/-小鼠肺泡腔内沉积的SF明显减少。但是该构建方法转染率较低，仅10%~20%［18］。2018年，该课题组进一步使用第三代慢病毒载体（self-inactivatinglentiviral vector，SIN）将小鼠Csf2ra基因转入Csf2ra-/-小鼠骨髓来源的谱系阴性细胞（lineage-negative hematopoietic stem and progenitor cells，lin-HSPC）。Csf2ra-/-小鼠经放射清髓后，接受改造后的lin-HSPC静脉输注治疗。经过2次移植，肺泡腔内的巨噬细胞表型接近于野生型小鼠（C57BL/6）肺泡巨噬细胞表型。小鼠BALF浑浊度和蛋白总量、BALF内GM-CSF和巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）浓度、胸部CT及病理均有好转，连续移植可使小鼠获得长达9个月的缓解期［19］。这种结合基因工程的造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）可以使术后可免于接受免疫抑制的相关处理，减少感染风险。
Richard A. Flavell课题组通过在严重免疫缺陷小鼠（Il2rg KO mice）内插入人源IL-3/GM-CSF基因片段构建了人源化PAP小鼠模型（huPAP）。然后通过对huPAP新生鼠行肝内注射人脐带血来源的CD34+细胞。移植8~12周后，肺泡内出现人源的CD68+的巨噬细胞，并且沉积的SF明显减少，BALF内的蛋白含量也有所降低［20］。这种huPAP小鼠模型在后续的研究中起到了重要作用。
2.（肺泡）巨噬细胞：随着新技术的出现，人们对肺泡巨噬细胞来源的认识更为深刻，逐渐证实肺泡巨噬细胞可在肺内稳态下自我更新，而非单一依靠单核-巨噬系统；并且高度依赖肺泡内微环境，这为PMT提供了理论基础［21］。hPAP患者或小鼠由于肺泡巨噬细胞受体缺陷，不能接受GM-CSF刺激，从而产生了一个高浓度GM-CSF的环境，这也为移植的肺泡巨噬细胞的发育和功能提供支持。因此，PMT成为hPAP治疗的新思路。
Trapnell课题组提取C57BL/6小鼠的原代巨噬细胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM），通过PMT完成了对Csf2rb-/-小鼠的治疗［10］。移植1次后可在肺内存在1年，小鼠肺内的蛋白沉积量、BALF浑浊度以及肺泡巨噬细胞对GM-CSF的反应均得以改善。移植肺内的BMDM（CD11bHiSiglecFLow）在肺泡微环境作用下逐渐转变为肺泡巨噬细胞（CD11bLowSiglecFHi）表型。这项研究从细胞生产到移植过程对PMT进行了系统的实验，使小鼠不需要经过HSCT预处理和术后的免疫抑制，保持了小鼠在移植后的免疫力，使移植过程更为安全。之后，该课题组继续利用Csf2ra-/-小鼠验证了该方法，同样取得了较好的疗效［22］。
Hansen课题组从C57BL/6小鼠骨髓中分离CD45.1+细胞，在体外经M-CSF作用形成BMDM。通过PMT将BMDM移植到Csf2ra-/-小鼠体内。经治疗9个月后，Csf2ra-/-小鼠的BALF浑浊度、BALF蛋白总量、胸部CT和呼气末暂停时间均有好转。之后继续利用huPAP模型，将健康人CD34+细胞来源的巨噬细胞（含有约35%的CD34+细胞）经PMT移植到huPAP小鼠当中，治疗后的小鼠在BALF和胸部CT方面均得到改善［23］。
除了BMDM，Martin Post课题组利用小鼠胚胎多能干细胞（PSC），制备出了PSC来源的Myb-肺泡样巨噬细胞，其表型比骨髓来源的巨噬细胞更贴近于正常野生型的肺泡巨噬细胞，并且其吞噬病原体和凋亡细胞的能力也优于BMDM［24］。随着人类肺泡巨噬细胞的发育及iPSC的研究深入，这种肺泡巨噬细胞可能会成为细胞移植治疗PAP的工具之一。
3. 诱导性多能干细胞（iPSC）：iPSC自问世以来，一直是干细胞领域研究的热点。其通过体细胞重编程（Oct3/4、Sox2、Klf4和cMyc）的方法，使之从分化终末状态的细胞重新回到胚胎干细胞，并通过有针对性的诱导使之成为新的有功能的细胞。iPSC不存在像胚胎干细胞一样的伦理学问题，重新诱导后也没有异体移植排异的难题。并且理论上可以源源不断的从患者体内获得细胞完成iPSC的制备［25, 26］。因此，科学家们也尝试利用iPSC生成有功能的肺泡巨噬细胞用于治疗hPAP。
Moritz课题组和Trapnell课题组分别利用hPAP患者的骨髓CD34+细胞和外周血单个核细胞（PBMC）构建了iPSC。验证iPSC的多能性后，通过M-CSF等细胞因子诱导形成巨噬细胞（iPS-Mφ）。然后通过慢病毒使iPS-Mφ表达CSF2RA蛋白，经过IL-6分泌实验、吞噬实验和蛋白印迹等实验，证实了使之成为具备正常功能的巨噬细胞［27, 28］。
Lachmann课题组从正常C57BL/6小鼠骨髓中分离出CD45.1+细胞，利用慢病毒载体转入构建iPSC，再诱导分化成巨噬细胞（CD45.1+iPSC-Mφ），并验证了其相关功能。同时，也从Csf2ra-/-小鼠骨髓内分离出了骨髓来源lin-细胞，重编程形成iPSC后，诱导分化成肺泡巨噬细胞［29］。之后，经气道单次移植iPSC-Mφ，于肺内其表型过渡为肺泡巨噬细胞表型，并且移植组小鼠肺内SF的沉积较未移植组明显好转［30］。这些实验证明了iPSC-Mφ移植对hPAP的疗效，同时也说明了肺内微环境对肺泡巨噬细胞表型的影响。
Hansen课题组从健康人体内获取细胞后利用慢病毒载体构建了hiPSC，以hIL3/hM-CSF刺激后形成iPSC-Mφ。体外验证其表型和吞噬能力后，将iPSC-Mφ细胞通过 PMT移植入huPAP。治疗2个月后BALF浑浊度、SF含量及病理均获得改善。huPAP小鼠BALF内出现人源CD45+细胞，移植后的iPSC-Mφ表型出现人的肺泡巨噬细胞表型（CD11blowCD14-）［31, 32］。
三、细胞治疗hPAP临床研究
基于以上临床前研究，目前有4例hPAP患者接受了细胞治疗，多为反复多次接受WLL治疗的患者。
第1例接受HSCT治疗的hPAP患者为4岁女性患儿，患有Turner综合征，在3岁时确诊PAP，基因测序显示CSF2RA外显子5-13缺失，该患者于接受HSCT后4周死亡，死因是肺部感染，未能进行治疗后PAP长期疗效评价［33］。
第2例接受HSCT治疗的hPAP患者为6.3岁女性患儿，其在2.6岁时确诊hPAP（母亲来源的X染色体CSF2RA和CRLF2缺失；CSF2RA等位基因缺失）。其HSCT使用的造血干细胞由1名男性非亲缘供者提供（10/10 HLA位点相合），治疗剂量为121.6×106个CD34+细胞。移植后15 d BALF中供体嵌合率达到94%，全血嵌合率达到100%，其BALF内泡沫样细胞数目明显减少。之后患者的呼吸状况逐渐好转，需氧量也在减少。第66天出现急性GVHD（皮肤Ⅱ度，肠道Ⅳ度），后续用六联的免疫抑制方案控制。移植后6个月，患者的CT表现和肺功能正常，未再接受WLL治疗［34］。
第3例患者为18岁男性，其在4岁时确诊hPAP（CSF2RA基因外显子2-13同源性缺失，父母均不携带该突变）。其父亲作为供者（10/10 HLA位点相合）为患者了造血干细胞和骨髓来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）。在进行HSCT之前，患者接受了2次MSC的输注。全血嵌合分析显示，在第23天时其嵌合率达到94%，第75天为97%。患者的活动耐力和需氧量均明显下降。3个月后影像学明显好转，4个月后BALF浑浊度改善。但是患者之后出现了急性GVHD，并先后合并了巨细胞病毒和真菌感染，最终死于脓毒血症和多器官衰竭［35］。
第4例患者为24岁男性，在35个月时诊断为hPAP，13岁时遗传分析（染色体Xp22.3和Yp11.3大量纯合缺失，导致CSF2RA全缺失）。双亲均为X、Y染色体PAR1基因缺陷杂合子携带者，确诊为hPAP。患者在19岁时行双肺移植，并于肺移植后336 d行HSCT，干细胞供者为21岁男性（10/10 HLA位点相合）。患者肺移植后4.5年未发生PAP复发［36］。
此外，也有部分病例报道使用HSCT治疗继发性PAP，如原发性免疫缺陷（primary immunodeficiency，PID）和骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）等疾病。有研究报道了1例58岁女性患者，诊断为难治性血细胞减少伴MDS的继发性PAP。患者接受来自HLA相同的非亲缘供体的同种异体造血干细胞移植（异基因HSCT）。异基因HSCT后8个月的CT显示肺部浸润有所改善。其移植后18个月死于胃癌［37］。第2例患者是1名30岁女性患者，诊断为家族性MDS（GATA2突变）的继发性PAP。患者成功接受了HSCT治疗，4个月后PAP相关症状缓解［38］。对于继发性PAP而言，继发于血液系统的PAP可采用HSCT治疗，其主要针对原发病的治疗，同时对PAP也有疗效。
四、总结
PAP的细胞治疗目前集中于hPAP的治疗，短短不到30年取得了重大突破。从最初的骨髓来源到肺泡腔内获取，再到现在的iPSC，细胞获取途径逐步从有创到微创，从提取体内干细胞到体外扩增干细胞，这些都是在基因编辑技术和iPSC培养技术发展的大背景下逐步完成的，未来有较大的转化前景。但是PAP患者少，开展大型临床研究较为困难，诊断和治疗要求高水平的医疗平台。同时，细胞治疗和基因治疗作为新型的治疗手段，有较高的准入标准，其安全性和有效性仍需要更多的临床评价。
临床研究的发展紧随着临床前研究的成果在进行，虽然病例数量少，但是也初步证明通过HSCT重建造血系统和肺泡巨噬细胞群是治疗hPAP的有效手段。随着对组织驻留巨噬细胞的认识，尤其是命运图谱分析的发展，逐渐认识到肺泡巨噬细胞来自于肺内巨噬细胞祖细胞未来利用3D培养技术体外模拟肺泡微环境的发展也必将推动这群细胞体外扩增的发展。气道介入技术的发展也将推动PMT治疗，精细化原件和高分辨率图像将更有助于目标细胞的定向递送。
随着对PAP的不断深入研究，人们对其发病机制的认识逐渐加深干细胞治疗为PAP的治疗提供了新的思路，将成为惠及更多PAP患者的新疗法。
参考文献（略）
作者：张梦妮 金晶 宋新宇 李时悦；单位：广州呼吸健康研究院 呼吸疾病国家重点实验室 广州医科大学附属第一医院 国家呼吸医学中心
引用本文: 张梦妮, 金晶, 宋新宇, 等. 细胞治疗在遗传性肺泡蛋白沉积症中的研究进展 [J] . 中华结核和呼吸杂志, 2023, 46(7) : 730-734. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20230107-00008.
本文转载自订阅号「中华结核和呼吸杂志」（ID：cmjlung）
原链接戳：【综述】细胞治疗在遗传性肺泡蛋白沉积症中的研究进展
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