摘要

高毒力耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（hv-CRKp）已对公共健康造成严重威胁。在这里我们报道了一例hv-CRKp相关致死性临床感染并揭露了其抗菌药物耐药及宿主内进化机制。在一位肺移植患者1.5年抗菌治疗过程中，我们共分离出了1株碳青霉烯类敏感菌（CSKp）及11株产KPC酶的CRKp。PFGE结果显示CSKp和CRKp分为两簇。进一步的WGS分析发现11株CRKp为ST11-KL64型，CSKp则属于ST412-KL57型。在11株CRKp菌株中，分别有3株及1株对粘菌素及头孢他啶/阿维巴坦（CAZ/AVI）耐药。3株粘菌素耐药机制各不相同，包括不同的IS元件（ISKpn74 和 IS903B）插入到mgrB基因的相同位点以及不明原因的外排泵相关机制。CAZ/AVI耐药机制则与bla_KPC-2有关。除此之外我们还发现尽管没有到达耐药水平，bla_KPC-2的表达量增加也可以提高CAZ/AVI的MICs值。12株菌均含有iucABCDiutA 毒力簇及相关毒力基因rmpA/rmpA2,同时它们的铁载体产量显著高于经典参考菌株（cKp），因此我们认为12株菌均属于hvKp。然而随后的黏液实验显示只有CSKp为高粘表型。基因分析表明除了第一株CSKp以外，所有CRKp均存在粘液相关基因rmpA基因突变（ISKpn26元件插入）情况。总而言之，该项研究报道了一项ST11-KL64克隆相关的hvKp快速且复杂的宿主内耐药进化机制。

引言

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKp)已成为严重威胁公共卫生的病原体。克隆复合体258 (CC258)是在全球播散的主要CRKp克隆之一，其中序列型11 (ST11)是中国医院获得性CRKp的主要克隆。值得注意的是，产碳青霉烯酶KPC-2的ST11克隆是中国CRKp的主要克隆，因为它们可以迅速传播并引起高死亡率和发病率。近年来，在我国重症监护病房(ICU)，碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌(CSKp)定植后频繁出现产KPC-2的ST11型高毒力CRKp菌株(ST11 hv-CRKp)感染，其表现为高传播力、高耐药和高毒力，严重威胁人类健康。黏菌素和头孢他啶/阿维巴坦(CAZ/AVI)是中国hv-CRKp感染的最后治疗选择。然而，在临床治疗过程中也出现了相应的耐药问题。本研究分析了一系列产KPC-2的ST11 hv-CRKp菌株的宿主内进化，这些菌株是从1例接受了1.5年抗生素治疗的肺移植患者体内收集得到的，它们展示出了相当大的遗传和表型变化，以此适应复杂的抗菌药物治疗。这些结果突出了产KPC-2的ST11 hv-CRKp菌株的宿主内适应能力。

研究方法

本研究从一名肺移植患者中共分离出了12株肺炎克雷伯菌，随后进行临床用药分析，药敏试验，PFGE，生长曲线，以及拉丝实验，黏液实验，铁载体定量实验等毒力表型实验，随后进行WGS及生信分析，并通过rt-PCR，外排泵抑制分析等验证及探寻耐药原因。

研究结果

抗菌药物耐药表型和毒力表型

除第一株CSKp菌株(K26467)外，其余11株CRKp的AST谱相似，对除替加环素外的大部分试验抗菌药物均耐药。同时，鉴定出3株多黏菌素耐药株(K28074、K28387和K30821)和1株CAZ/AVI耐药株K29366。两株菌株(K26467和K28074)在拉丝试验中表现出高黏液表型。然而，黏液实验显示，只有第一株K26467的黏液黏度相对高于其他11株菌株和cKp菌株ATCC 700603。进一步对铁载体进行定量分析显示，这12株菌株的铁载体产量均高于参考菌株ATCC 700603。此外，虽然11株CRKp菌株的生长速度略快于CSKp菌株K26467，但未发现它们之间有显著的生存差异。

患者病史

表型实验结果

a，使用黏液粘度沉淀法测定黏液表型；

b，铁螯合M9微量培养基(c-M9-CA)中检测铁载体生成实验；

c，LB中的生长曲线

表型和基因型分析

PFGE分析显示，除CSKp菌株(K26467)外，其余11株CRKp菌株均属于同一PFGE分型。全基因组测序结果显示，这11株CRKp均属于ST11-KL64型，而菌株K26467属于ST412-KL57型。11株ST11-KL64 CRKp中有9株聚为同一cgMLST组，等位基因差异小于10，命名为Cluster 1，而K28675和K29366分别聚为Cluster 2和Cluster 3。11株ST11-KL64型CRKp均携带bla_KPC-2基因，其中K29366株存在bla_KPC-33突变。基于SNP的系统发育树表明11株ST11-KL64 CRKp菌株为单系进化枝。除此之外，我们发现了共25起遗传事件包括SNP、缺失、插入和复合物，其中大多数发生在染色体上(n = 18)。

根据WGS结果，11株CRKp菌株均携带12种耐药基因，包括bla_KPC、bla_SHV-12、bla_TEM-1B、bla_CTX-M-65、fosA、fosA3、dfrA12、aadA2、rmtB、mph(A)、qacE和sul1。随后鉴定出了与黏附、抗吞噬、外排泵、铁获取、调节、分泌系统和血清耐药相关的毒力因子，因此11株均属于hv-CRKp。第一株CSKp也检测到大量毒力基因为hvKp。考虑到不同的高黏液表型，我们对夹膜多糖（CPS）调节基因rmpA/rmpA2进行了PCR扩增及测序。结果表明rmpA基因在所有hv-CRKp菌株中均被ISKpn26阻断。

PFGE图

a,11株CRKp的cgMLST谱的最小生成树(≤15个等位基因的距离定义为一簇)；b，11株CRKp的SNP系统发育树以及CRKp耐药基因和毒力基因的分布图。

ST11-KL64 hv-CRKp的比较基因组分析

根据11株ST11-KL64 hv-CRKp的耐药特征和基因组信息，选择K28074为代表进行后续分析。该菌株含有5个质粒pvil - k28074、pSul1-K28074、pKPC-K28074、punnamed1和punnamed2，质粒大小分别为237.1、131.6、98.2、11.9和5.6 kb。在pLVPK样毒力质粒pVir-K28074上鉴定出包括rmpA(被ISKpn26中断)、rmpA2、iucABCDiutA和iroBCDN簇在内的毒力因子，查询覆盖率超过90%，与质粒pLVPK (NC_005249.1)和pK2044 (NC_006625.1)的一致性达到99%。

pKPC-K28074质粒属于IncFII/R型自转移质粒，携带包括bla_KPC-2基因在内的多种耐药基因。该质粒与肺炎克雷伯菌的IncFII/R型质粒pKPGD4 (CP025952.1)、p26041-KPC (MT810363.1)和pKP6106_KPC (MW465706.1)具有98%以上的覆盖率和100%的同源性。质粒pSul1-K28074携带多种耐药基因，该质粒具有与XJ-K1 unnamed 2 (CP032165.1)相似的骨架序列。

K28074和K30821中携带bla_KPC-2的质粒具有较高的同源性，覆盖率为98%，同源性为100%。在位置4-20 kb处鉴定出5个拷贝IS26，在携带bla_KPC-2质粒的菌株K30821中也鉴定出IS26介导的fosA3基因缺失发生，表明该区域发生了同源重组。

K28074的基因组特征分析

a, 将K28074菌株与肺炎克雷伯菌NTUH-K2044 (NC_01273.1)菌株的全染色体基因组进行比较。研究发现了多种毒力因子(1型菌毛、3型菌毛、耶尔森菌素、T6SS-I、T6SS-III、Ent铁载体和外排泵)和一个耐药基因fosA;

b, K28074菌株的毒力质粒。该质粒pVir-K28074大小为237 kb，携带elf毒力基因，与两个毒力质粒pLVPK (NC_005249.1)和pK2044 (NC_006625.1)具有高度同源性。该质粒上还有介导毒力基因失活和黏菌素耐药性的重要IS元件;

c, K28074菌株的另一个耐药质粒pSul1-K28074。该质粒具有与XJ-K1质粒未命名2 (CP032165.1)相似的骨架序列。

K28074和K30821 bla_KPC-2质粒的序列比对和mgrB基因两个插入事件的示意图

a, pKPC-K28074的耐药变异区域位于4-20 kb。在耐药变异区检出5个拷贝的IS26和耐药基因；

b， K28074和K30821菌株的mgrB基因分别被ISKpn74和IS903B插入失活。

通过不同的进化途径出现多黏菌素耐药性

患者在1.5年期间接受了复杂的抗微生物治疗。相应的其细菌对抗菌药物的敏感性也发生了复杂的变化，尤其是对多黏菌素。具体而言，第一株CRKp菌株K27356在给予多黏菌素B和替加环素后迅速产生了黏菌素耐药性(K28074和K28387)。更换为CAZ/AVI后，这些菌株恢复了对黏菌素的敏感性。后半程虽以CAZ/AVI为主，但多黏菌素B联合替加环素治疗3 d后1个月仍出现多黏菌素耐药现象(K30821)，此后多黏菌素耐药表型无明显变化。3株肺炎克雷伯菌K28074、K28387和K30821对黏菌素的MIC分别为64 mg/L、32 mg/L和128 mg/L，未检测到mcr基因。分析与多黏菌素耐药相关的染色体基因(mgrB、pmrABCDK和phoPQ)的突变情况。在K28074和K30821菌株中发现了mgrB基因80-81位点的插入失活。有趣的是，对于菌株K28074，插入序列为ISKpn74(同源性100%)，而对于菌株K30821，此处插入了IS903B样插入序列(同源性97%)。进一步比较显示，这两个IS元件之间有87%的一致性。然后，我们搜索了菌株K28074的全基因组，在质粒pVir-K28074中发现了3个拷贝的ISKpn74。在mgrB均失活的菌株K28074和K30821中，phoPQ、pmrK和pmrD的转录水平显著高于随机选择的3株携带野生型mgrB的粘菌素敏感菌株(K27356、K28882和K29366)。

K28387的mgrB、phoPQ和pmrABCDK基因未发现突变。此外，未观察到phoPQ和pmrABCDK的表达发生显著变化。加入非特异性外排泵抑制剂CCCP逆转了多黏菌素的耐药性，MIC从32 mg/L下降到2 mg/L(下降了16倍)。而加入AcrAB-TolC泵抑制剂后，对黏菌素的MIC无明显影响。AcrAB-TolC泵相关基因ramR、ramA、acrA、acrB、rpsJ和soxS，以及已报道的kpnEF、kpnGH等泵基因均未发现突变。

CAZ/AVI敏感性的变化

bla _KPC 基因和粘菌素耐药相关基因(pmrHK, phoPQ, pmrD and pmrCAB)的相对表达量

在病程中，这11株ST11-KL64菌株对碳青霉烯类和CAZ/AVI的耐药表型呈动态变化。前6株菌株(K27356、K28074、K28387、K28675、K28882和K29301)对CAZ/AVI敏感，对碳青霉烯类耐药。使用CAZ/AVI近2个月后收集的菌株K29366对碳青霉烯类药物恢复敏感，对CAZ/AVI耐药。值得注意的是，在K29366后约半个月分离的菌株K29566在停用CAZ/AVI后恢复了对CAZ/AVI的敏感性和对碳青霉烯类药物的耐药。此后多次使用CAZ/AVI，均未检出CAZ/AVI耐药株。与表型变化相对应，肺炎克雷伯菌的基因型由野生型bla_KPC-2转变为bla_KPC-33 (bla_KPC-2的单核苷酸变异)，然后又恢复为野生型bla_KPC-2。此外，bla_KPC-33的表达水平也显著高于敏感株K27356。值得注意的是，虽然菌株K29566、K30309和K30821对CAZ/AVI均敏感，但与菌株K27356相比，菌株K29566、K30309和K30821对CAZ/AVI的MIC至少增加了4倍(分别为4 mg/L、8 mg/L和4 mg/L)。此外，bla_KPC-2在这3株菌株(K29566, K30309和K30821)中的表达水平升高，其中K29566和K30309有统计学差异。

结论

本研究报道了一例肺移植患者感染的hv-CRKp菌株的复杂的宿主内进化。在1.5年的抗菌治疗中，我们确认了至少一个KPC-2突变以及3种粘菌素耐药机制。我们的研究结果表明ST11 hv-CRKp菌株快速复杂的抗菌药物敏感性变化需要得到社会得广泛关注。

Within-host resistance evolution of a fatal ST11 hypervirulent carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

Article，2023-02-08, 国际抗菌剂杂志, [IF 15.441]

DOI：10.1016/j.ijantimicag.2023.106747

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2023.106747

主要完成单位：中日友好医院

通讯作者：曹彬（中日友好医院）

第一作者：蒲丹妮（北京协和医学院），赵建康（中日友好医院）

其他作者：鲁炳怀，武永莉，李子尧，张玉林，卓献霞

本文完

责编：Jerry