摘要

除临床表现、病史、影像学外，下呼吸道感染（LRTI）的诊断水平主要依赖于临床微生物学实验室病原学检测能力，但常规培养耗时长，显微镜检的敏感度低，PCR等分子生物学检测方案覆盖的病原类别有限。近年来宏基因组测序（mNGS）技术的应用提高了LRTI的诊断率，从而也出现对常规微生物检测能力不重视的现象。本文对如何适当使用上述检测方法加以评述，并建议在mNGS背景下，进一步加强临床微生物检测能力的建设。

近年来随着老年人群增加、慢性疾病患者寿命延长（糖尿病、严重肝肾疾病）、免疫相关治疗增加（移植、化疗、免疫抑制剂使用）等，导致免疫功能低下的人群相对增加，包括细菌、病毒、真菌、寄生虫在内等病原微生物所致感染增多，给病原学诊断带来了挑战［1］。下呼吸道感染（low respiratory tract infection，LRTI）主要通过临床症状、病史、影像学、生物标志物和急性相炎症反应指标、病理学、实验室病原学检测等方法综合诊断，其中临床表现与影像学常无特异性，如肺侵袭性真菌病与肺结核、非结核分枝杆菌（nontuberculosis mycobacteria，NTM）感染、肺诺卡菌病等，鉴别诊断困难，同时还可能存在肺部真菌、细菌或病毒的混合感染或继发感染的情况［2］。病理学检测需采集组织样本，为有创性操作，并且难以明确病原类别。因此微生物诊断是确诊的重要手段。近年来宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）用于多种临床样本的病原学检测，有助于LRTI病原学诊断，具有重要的临床价值，然而，对于测序报告的解读，还存在很多问题［3, 4, 5］。同时出现了重视mNGS，忽视常规微生物检测的现象。

呼吸道有大量微生物定植。mNGS检测到的微生物序列，可能来源于致病微生物，也可能来源于正常菌群、一过性定植或样本污染，甚至是数据库比对错误的结果。例如：曲霉属、毛霉目常见于周围环境中，在健康人的呼吸道可有定植或者核酸的残留。口腔或上呼吸道有草绿色链球菌、葡萄球菌、厌氧菌、念珠菌定植。NTM可在呼吸道定植。不同类别的NTM致病力也有所差异，如戈登分枝杆菌引起感染的可能性较少，多为样本采集或检测过程污染所致。NTM病的临床诊断有严格标准［6, 7］。如果通过mNGS检出NTM，临床价值如何？是否可参照此类标准，均需要更多的临床研究确认。mNGS是用测序的方法检测核酸，并不意味着即为致病菌。mNGS可能在报告单中给出数种甚至数十种微生物，给临床带来很大的困惑。因此，传统微生物学检测仍然应作为一线手段使用。特定患者送检mNGS，应同时送检传统病原学检测，多种手段联合，结果互相印证，同时结合患者的病情、免疫状况和影像学表现，才能做出符合患者病情的正确诊断。

《下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识》（以下简称《共识》）中多处指出，mNGS结果在如下情况下，需要采用其他检测手段进行验证：（1）所检出病原微生物的reads数较低；（2）与临床表现不符；（3）检测到少见或罕见病原微生物。临床微生物常规检测能力的弱化，将给临床诊断带来困惑和挑战，甚至导致严重的抗微生物药物的滥用。

例如：面对一例免疫能力严重低下的重症LRTI患者，mNGS的报告中常出现复杂多样的微生物，包括鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、梭菌属、曲霉、毛霉、肺孢子菌、巨细胞病毒等，哪一种或哪几种是致病病原微生物？是否需要干预？如果没有对感染与微生物的深刻理解，没有常规微生物检测的能力，临床将出现按reads数的高低去推断病原，甚至不分青红皂白，以治疗或者预防感染的名义，对mNGS检测报告所列出的所有病原进行全覆盖的情况。这是我们在《共识》中极力反对的。

另一方面，临床微生物实验室检测，涉及病原类别广，专业性强。加强其基础检测能力建设，与mNGS技术融合，将有利于LRTI病原的诊断。临床微生物检测能力，主要体现在从业人员专业素质与检测项目的覆盖范围：（1）从业人员专业能力建设：《共识》建议对于疑难病例，结合mNGS报告组织疑难LRTI多学科团队（MDT）会诊，对于微生物人员专业能力提出挑战，要求微生物人员对病原的微生物特性、致病力、定植与感染可能性、如何进一步诊断、治疗抗生素的选择等提出切实可行的建议［8］。目前的困境在于部分微生物学从业人员，特别是基层人员，埋头于实验室内部工作，对于检测质控、流程关注较多，对于临床诊疗知之甚少。多层级的培训，沟通临床与检验的医师大量出现，才有望解决这一问题。（2）临床微生物检测项目建设：病原微生物种类繁多，针对细菌、真菌、病毒、非典型病原体等，实验室应提供不同的检测手段。部分重要的检测项目与对应病原体见表1。以下几个方面有赖于传统微生物检测。

1. 显微镜检查：包括革兰染色、抗酸染色、弱抗酸染色、KOH、六胺银染色和荧光染色等方法。显微镜检具有如下特点：（1）方便、快速。（2）可以直观观察细菌、真菌等病原微生物与炎症细胞、组织细胞的关系，判断样本采集的质量，是否来源于感染部位。此外，显微镜检在样本中病原载量较多时才能见到，敏感度通常较低。病原数量少时难以有阳性结果。换言之，如果能在显微镜下检出，常意味着此种病原菌数量较多，而菌量多常与感染密切相关。显微镜检对某些病原的诊断极有帮助：①判断呼吸道样本中鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等致病力弱且住院患者使用抗生素后呼吸道常有定植的细菌是否为感染；②判断社区感染未使用抗生素的患者是否有肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、金黄色葡萄球菌等感染；③判断支气管镜下见到呈脓性、血性等疑有感染的分泌物是否有丝状真菌、诺卡菌等病原微生物。（3）病理组织切片制片与微生物实验室制片方法不同，采用的染色手段也更多样化，但镜检内容不同，建议微生物借鉴病理制片的方法，对肺组织的隐球菌属、曲霉属、毛霉目（包括根霉属、毛霉属、横梗霉属、小克银汉霉属及根毛霉属）、放线菌的诊断有重要价值。

需要注意的是，对于肺侵袭性真菌（不包括肺孢子菌）、分枝杆菌、需氧放线菌（主要为诺卡菌属）等病原，mNGS的检出率，因为上述病原细胞壁厚，提取核酸困难等原因，敏感度常不高［9］。另外，部分真菌培养困难，有时在显微镜检见到大量菌丝，但培养结果阳性率不高，尤以毛霉目、球孢子菌培养更为困难。曲霉属与毛霉目真菌在周围环境中可见，也可以孢子形式吸入呼吸道而定植，培养阳性不一定意味着感染，mNGS等分子生物学手段阳性也同样如此［10］，显微镜检有助于鉴别其临床价值。很多微生物实验室又不开展分枝杆菌培养与真菌培养，因此，这些病原的显微镜检就显得尤为关键。

2. 培养：分离培养鉴定病原微生物，是感染诊断的「金标准」。mNGS的靶标是核酸，某些情况下不能等同于活的致病微生物。例如，BALF留取时，如曾用于结核分枝杆菌感染患者样本采集的设备消毒后，病原体死亡，但依旧有可能残留DNA，对下一个患者的样本形成核酸污染。而病原体是否存活，微生物实验室常采用培养的方法进行证实。隐球菌属与曲霉属相对毛霉目而言容易培养。分枝杆菌推荐采用液体培养的手段，可提高阳性率，缩短报告时间。

此外，培养出致病菌菌落，也是药敏实验的前提。《共识》中提到mNGS可报告耐药基因。除部分耐药基因，包括碳青霉烯酶耐药基因对于肠杆菌目细菌、mec A基因对于葡萄球菌、结核分枝杆菌的耐药基因等，具有较明确的临床价值［11, 12］，指导临床用药还有赖于培养与药敏实验。

3. 免疫学诊断试验：对某些病原微生物具有重要价值，具体见表1。例如，患者免疫状况较好，检测出低reads数肺孢子菌，影像学无磨玻璃影等特征性表现，G试验无不明原因升高，可暂不考虑肺孢子菌肺炎诊断。如检出隐球菌低reads数，应首选用隐球菌荚膜多糖抗原实验去验证，如为阳性即考虑为肺隐球菌病诊断成立，如为阴性，应结合其他手段，包括BALF或肺穿刺组织穿刺行显微镜检与培养等，因为血清隐球菌荚膜多糖抗原实验的敏感度偏低（如未侵袭脑组织，20%~50%）。半乳甘露聚糖试验（GM）主要用于侵袭性肺曲霉病的辅助诊断。曲霉IgG抗体试验用于变态反应性支气管肺曲霉病与慢性肺曲霉病的实验室诊断。（1，3）-β-D葡聚糖试验（G试验）对念珠菌血流感染有重要诊断价值，同时如>200 mg/ml支持肺孢子菌肺炎的诊断。

4. 分子生物学实验：包括普通PCR、实时荧光定量PCR、巢式PCR与数字PCR、恒温扩增技术。特别是快速多重分子生物学技术，通过设计多重引物，针对不同的病原体核酸或耐药基因进行特异性扩增，可以在一次PCR反应中实现对多种病原体、多种耐药基因检测，在欧美等发达国家应用较多［13］。多种病原体的即时检测（point-of-care testing，POCT），1 h内给出检测结果，代表着病原快速检测的重要方向。结核病的诊断中，GeneXpert为WHO推荐的检测方案，可同时提供结核分枝杆菌的有无与利福平的耐药结果。

mNGS本身也属于分子生物学检测，对于表1中的非典型病原体、病毒具有很好的检测能力，缺点在于价格偏高与时间较长。

总之，LRTI的临床诊断，特别是病原学诊断存在很多挑战，mNGS的应用给LRTI诊断提供了重要手段，也带来一系列亟待解决的问题［3，14］。在mNGS的应用背景下，常规微生物的检测能力更应该加强，而不是削弱。

参考文献（略）

作者：鲁炳怀；单位：中日友好医院呼吸与危重症医学科 临床微生物与感染实验室

引用本文: 鲁炳怀. mNGS应用背景下的下呼吸道感染病原学检测基础能力 [J] . 中华结核和呼吸杂志, 2023, 46(4) : 315-318. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20221121-00915.

本文转载自订阅号「中华结核和呼吸杂志」（ID：cmjlung）

原链接戳：【专题笔谈】mNGS应用背景下的下呼吸道感染病原学检测基础能力

本文完

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