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病例摘要
男，72岁
主诉
咳嗽、气短1年余，痰中带血10天
病史
1年余前，受凉后出现咳嗽、咳白痰，伴气短，活动后明显，平地步行约400米，爬2层楼梯后即可出现，诊断为间质性肺炎。开始长期口服「吡非尼酮、醋酸泼尼松」治疗，后因右下肢皮肤带状疱疹，停用泼尼松片，仅服用「吡非尼酮 300mg/日」，气短症状无明显改善。10天前出现咳嗽、咳痰，痰中带血1次。
入院查体
T 37℃，P 114bpm，R 25bpm，Bp 147/77mmHg。杵状指（+），双肺下野可及Velcro啰音，未闻及哮鸣音。
实验室检查
气管镜下见大量黄色脓性分泌物附着，气管镜刷检后出血明显，气管镜下留取痰行病原学检查见肺炎克雷伯菌及铜绿假单胞菌，予哌拉西林舒巴坦5.0 Q8h 抗感染。
PPD、T-Spot均（-），支气管镜刷片及BALF抗酸杆菌涂片染色均（-） 。
血清G试验（-）、血清 GM试验（-），BALF真菌涂片（-）。
血清 CA72-4 14.48U/mL， CA125 315.2U/mL，CA-199 266.4U/mL，CA-153 124.4U/mL，Pro-GRP 62.38pg/mL，Cyfra21-1 5.14ng/mL，SCC-Ag 2.4ug/L。
气管镜刷片及BALF细胞学检查未见癌细胞。
临床诊断
肺间质纤维化合并感染 （细菌明确、真菌？）
胸部HRCT可见右肺上叶片状渗出影，伴可疑空洞
治疗：细菌：（kpn、pae）诊断明确，予哌拉西林舒巴坦5.0 Q8h 抗感染治疗
真菌：虽然血清G试验、血清GM试验及真菌涂片实验室检查阴性，但综合其影像表现及气管镜刷检易出血的特点，临床考虑可能合并真菌感染，经患者家属同意，给予患者经验性伏立康唑抗真菌治疗
BALF真菌培养——菌落形态
BALF标本真菌培养3天后，可见毛绒样的白色菌落，图为培养5、12天的菌落形态
BALF真菌培养——显微镜下形态
BALF培养5天后菌落压片（棉兰染色）显微镜下形态特点：产孢少 ，分生孢子梗光滑，顶囊烧瓶型，在顶囊的2/3处单轮生小梗排列紧密。
菌落分子鉴定
its区及β-微管蛋白测序
引物：
ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
bt2a: 5’-GGT AAC CAA ATC GGT GCT GCT TTC-3’
bt2b: 5’-ACC CTC AGT GTA GTG ACC CTT GGC-3’
测序结果：迟缓曲霉菌
真菌感染也明确诊断，患者严重的结构肺病合并细菌和真菌感染
曲霉菌
子囊菌门，丝裂孢纲真菌，目前有339个种
相关参考网址、书及文献：www.mycobank.com、www.aspergilluspenicillum.org
MCM11：>250种，64%是无性期
Clinical Microbiology and Infection 20 (2016) 662～669.（339种）
1965年Raper and Fennell根据形态学特征将132种曲霉分为18个亚组
分子进化研究采用四个基因
Internal Transcribed Spacer ( ITS ) 和 Large Subunit ( LSU )
β-微管蛋白（ β-tubulin）
钙调蛋白（Calmodulin）
RAN聚合酶Ⅱ2（RPB2）
2008年Peterson 等将曲霉分为5个亚属和 16个部分
2014年Samson 等将曲霉分为4个亚属和 20个部分
迟缓曲霉：烟色亚属，烟色section，我们熟悉的烟曲霉也在这个亚属
2004年美国Balajee 等在筛查128例干细胞移植患者分离的烟曲霉是否对伊曲康唑耐药的菌株时，发现其中一些形态学鉴定为烟曲霉的菌株，对抗真菌药物的敏感性降低，且形成毛绒样的白色菌落。当时将其描述为烟曲霉变种。
左图：烟曲霉的典型蓝绿色孢子形成菌落
右图：产孢很少的、主要由无色菌丝组成的烟曲霉变种的蓬松白色菌落
（ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Apr. 2004, p. 1197–1203）
同一个研究团队在2005年，经进化分析（5个基因的多位点序列分析），阐明了烟曲霉变种的分类地位——确认其为一个具有耐药性的曲霉新种，并命名为迟缓曲霉。
the -tubulin gene
the rodlet A gene
the salt-responsive gene
the mitochondrial cytochrome b gene
the internal transcribed spacer regions
显微镜下特点：迟缓曲霉的顶囊和分 生孢子均稍小于烟曲霉
生长特点：烟曲霉48℃生长；迟缓曲霉48℃不生长；形态学鉴定易错误鉴定为烟曲霉。
（EUKARYOTIC CELL, Mar. 2005, p. 625–632）
迟缓曲霉菌的形态学特点
迟缓曲霉菌落形态特征：
临床分离的3株迟缓曲霉菌落形态特征：
文献报道不同培养基中迟缓曲霉菌落形态特征：
迟缓曲霉显微镜下形态学特征：
文献报道的迟缓曲霉有性阶段的形态特征：
(A) Paired cultures of isolates78-2 (MAT1-2)78-3 (MAT1-1) on oatmeal agar (9-cm-diameter petri dish) with cleistothecia (arrows) along the barrage zones following 3 weeks of incubation at 28°C.
Eukaryotic Cell p. 962–969
Close-up of a barrage zone showing pale yellow cleistothecia. Scale bar, 400 m.
Eukaryotic Cell p. 962–969
SEM micrograph of a cleistothecium showing the interwoven hyphae that form the peridial wall. Scale bar, 100 m.
Eukaryotic Cell p. 962–969
SEM micrograph of lenticularascospores (white arrow) and smaller globose conidia (black arrow). Scale bar, 10 m.
Eukaryotic Cell p. 962–969
迟缓曲霉：
药物敏感性特点：对抗真菌药物的敏感性降低包括唑类药物、两性霉素B、棘白菌素类
本例患者未做药敏试验
到目前为止，仅有几例迟缓曲霉引起侵袭性感染的报道。多数的菌株是在器官移植患者（包括心脏移植、肝移植、肾移植、干细胞移植）中分离，同时伴随不良的预后。
迟缓曲霉侵袭性肺部感染 - 慢阻肺
体外药敏试验：
两性霉素B（MIC 4 mg/L）
伊曲康唑（MIC 3 mg/L）
沃尔康唑（MIC 1.5 mg/L）
卡泊芬净（MEC > 32 mg/L）
（Rev Iberoam Micol 2008; 25: 246-249）
迟缓曲霉侵袭性肺部感染 - 心脏移植患者
药敏：两性霉素B（MIC 2 mg/L）、伊曲康唑（MIC 0.25mg/L）、沃尔康唑（MIC 1 mg/L）、伯沙康唑（MIC 0.125 mg/L）、卡泊芬净（MEC > 16 mg/L）
治疗：沃尔康唑——换成卡泊芬净和两性霉素B——换成伊曲康唑——患者死亡
BALF标本巴氏染色：菌丝被中性粒细胞和含铁血黄素的肺泡巨噬细胞包围
（Transplant Infectious Disease 2012: 14: E60–E63）
迟缓曲霉侵袭性肺部感染 - 肾移植患者
沃尔康唑（2x200 mg/天），患者康复
体外药敏结果：两性霉素B（MIC 0.5 mg/L）、伯沙康唑 （MIC 0.125 mg/L）、沃尔康唑（MIC 0.25 mg/L）、卡泊芬净（MIC 0.25 mg/L）
A：痰直接显微镜：白细胞（箭头）和菌丝（箭头）（革兰氏染色）
B：SDA; 42℃，3天菌落形态
C：载玻片培养的分生孢子结构
D：菌落压片的镜下形态
迟缓曲霉侵袭性肺部感染 - 肝移植患者
两性霉素B加卡泊芬净换成沃尔康唑加卡泊芬净——好转
体外药敏试验：两性霉素B（MIC 4 mg/L）、伊曲康唑 （MIC 0.5mg/L）、沃尔康唑（MIC 2 mg/L）、米卡芬净（MEC <0.015 mg/L）
（J Infect Chemother 21 (2015) 479e481）
迟缓曲霉侵袭性肺部感染 - 肺囊性纤维化
体外药物敏感性 ：两性霉素B（MIC 2 mg/L）、伊曲康唑 （MIC 2mg/L）、沃尔康唑（MIC 2 mg/L）、伯沙康唑（MIC 0.5 mg/L）、迟缓曲霉唑类药物的MIC值均高于烟曲霉
（ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Dec. 2011, p. 5459–5468）
目前共10例报道：2例治疗有效，3例没有转归，5例死亡。
本例患者终因严重的结构肺病及合并细菌和真菌感染死亡。
少见曲霉菌药物敏感性特征
烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉，至少48种曲霉与疾病相关
临床上不常见的致病曲霉
中日医院呼吸道标本中分离的不常见曲霉（2016.9～2017.10）
烟色亚属：
环形亚属Flavi部分和裸胞壳亚属的Terrei部分：
环形亚属Nigri部分和裸胞壳亚属的杂色部分：
裸胞壳亚属的Usti部分和环形亚属环形部分：
首先，与丝状真菌如毛霉，赛多孢霉或镰刀菌相比，这些曲霉在临床样本中的流行程度相对较高
其次，在临床实验室中鉴定这些曲霉是非常重要的，因为这些曲霉常出现对抗真菌药物的耐药
The use of multi-locus DNA sequence analysis has led to the description of previously unknown ‘cryptic’ Aspergillus species, whereas classical morphology-based identification of Aspergillus remains limited to the section or species-complex level. The current literature highlights two main features concerning these ‘cryptic’ Aspergillus species.
First, the prevalence of such species in clinical samples is relatively high compared with emergent filamentous fungal taxa such as Mucorales, Scedosporium or Fusarium.
Second, it is clearly important to identify these species in the clinical laboratory because of the high frequency of antifungal drug-resistant isolates of such Aspergillus species.
小结
目前，曲霉属分为5（4）个亚属（曲霉亚属、环孢亚属、裸胞壳属、烟色亚属和）和20（23）个组或部分，共339个种 。烟色亚属曲霉共有63个种。烟曲霉属于颜色亚属，在烟色曲霉中的其他曲霉如：迟缓曲霉、宇田川曲霉、绿垂曲霉等也可以引起侵袭性真菌感染。
传统的形态学检测方法不能将这些少见曲霉（如：迟缓曲霉）准确鉴定到种，对于这个问题的认识不足可能会带来严重的后果，因为这些菌株经常出现不同水平的对唑类和其他抗真菌药物的天然耐药。
临床会出现这些曲霉引起的侵袭性感染难治的病例，当我们遇到一些菌株很少产孢或出现不寻常的抗真菌药物耐药这些特点，技术人员应该能想到可能是这些少见曲霉的感染。
准确的鉴定这些曲霉需要特异的对微管蛋白和钙调蛋白等进行测序分析；准确的鉴定及抗真菌药物敏感试验可以帮助早期诊断和治疗这些曲霉引起的侵袭性感染。