前言

2022年10月，北京大学人民医院王辉教授团队开展了wcaJ失活的ST23-KL1高毒力肺炎克雷伯菌的毒力、适应性和碳青霉烯抗性的传播和进化的多中心研究。研究成果以「Evolution of Virulence, Fitness, and Carbapenem Resistance Transmission in ST23 Hypervirulent Klebsiella pneumoniae with the Capsular Polysaccharide Synthesis Gene wcaJ Inserted via Insertion Sequence Elements」为题，在《Microbiology Spectrum》（IF=9.043）上在线发表。北京大学人民医院王辉教授为该文的通讯作者，博士生王舒意和博士生丁奇为共同第一作者。

研究背景

与经典的CRKP和hvKP菌株相比，高毒力碳青霉烯耐药的菌株适应性代价降低，引起越来越多的担忧。然而，目前关于介导 CR-hvKP 出现的分子机制的相关研究仍然有限。

结果：肺炎克雷伯菌分离株的特征

本研究整合了11株来自全中国CRE Network的ST23-KL1肺炎克雷伯杆菌，发现其中4株高度耐受血清杀伤，但拉丝实验为阴性，4株中3株均携带 bla _KPC-2质粒。对这4株菌进行全基因组测序，发现其均在荚膜多糖合成区域（CPS区域）的wcaJ基因处发生了IS插入。其中拥有bla_KPC-2 质粒的3株菌的wcaJ被ISKpn26插入，而hvKP (C2768) 被ISKpn74插入。 这4株菌的O位点类型属于O1/O2v2血清型，且拥有完整的rmpD基因，与NTUH-K2044相同，排除了其它常规影响菌株毒力的因素。

图1：IS移动元件插入wcaJ基因示意图

这4株菌均从痰液样本中分离，所有患者均患有基础疾病，其中3位患者在感染前30天接受过抗菌药物的治疗。从NCBI数据库中下载185株ST23-KL1肺炎克雷伯菌，发现大多数ST23-KL1分离株有ISKpn74，表明这类移动元件有着插入wcaJ的潜在风险。

图2：公共数据库和自测菌株的系统进化分析

wcaJ在荚膜合成中起着关键的作用

我们检测了wcaJ基因的表达，发现wcaJ基因在这4个分离株中均低表达（图 3a和b）。通过糖醛酸定量实验，发现wcaJ被插入的菌株的荚膜多糖明显低于NTUH-K2044（图 3c）。为了证实这4株菌的低荚膜合成能力是由于wcaJ被插入引起的，对这4株菌进行了野生型wcaJ基因的回补（pComp_wcaJ）。在回补后所有菌株的荚膜产量明显增高（图 3d），其中C2768和C4599表现出高粘液表型。通过透射电镜观察到回补株有较厚的荚膜（图 3e和g），同时回补株的生物膜形成能力降低（图 3f）。

图3：荚膜相关表型分析

wcaJ基因对体内和体外毒力的影响

通过血清杀菌实验以及抗巨噬细胞吞噬实验，评估wcaJ基因对菌株体外毒力的影响。发现在回补wcaJ基因后，菌株抗巨噬细胞吞噬能力增强（图4a），但耐血清杀伤能力明显降低（图4c-f），而表面C3b补体粘附减少，不同于以往认为荚膜增厚有助于抵抗血清补体杀伤的观点。此外，应用小鼠感染模型评估wcaJ对体内毒力表型的影响，结果提示wcaJ功能失活可能会降低毒力水平。

图4：毒力相关表型分析

wcaJ基因失活增强了菌株的接合能力，降低了适应性代价

相较于野生株，回补株有着更高的适应性代价（图5）。为了检测wcaJ失活是否会影响碳青霉烯酶耐药质粒接合进入ST23-KL1菌株，我们利用CRISPR-Cas9技术敲除了C400和C1356菌株的KPC质粒，并在此基础上回补了野生型wcaJ基因。我们发现wcaJ失活能增强菌株的接合能力（P < 0.01）。

图5：生长曲线

小结

该研究发现了ISKpn26和ISKpn74插入到ST23-KL1的wcaJ基因中。ISKpn26是 bla _KPC-2质粒中最常见的移动元件之一，ISKpn74在ST23-KL1分离株中广泛存在，提示了ST23-KL1分离株wcaJ基因被插入的潜在风险。荚膜是与菌株毒力相关的重要成分，我们剖析了wcaJ对荚膜合成、毒力和适应性的影响。强调了wcaJ作为促进高毒力和耐药性结合的潜在作用，迫切需要提高对此问题的关注度。

原文链接

https://journals.asm.org/doi/full/10.1128/spectrum.02400-22?rfr_dat=cr_pub++0pubmed&url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori%3Arid%3Acrossref.org

作者简介

王舒意

北京大学人民医院检验科2020级博士研究生，导师：王辉教授。主要研究方向：高毒力耐药肺炎克雷伯菌机制探究。参与多项国家级项目。

丁奇

北京大学人民医院检验科2020级博士研究生，导师：王辉教授。主要研究方向：碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌耐药机制。参与多项国家级项目。

作者：王舒意、丁奇（北京大学人民医院检验科）；审校：王启（北京大学人民医院）

本文转载自订阅号「京港感染论坛」（ID：PIDMIC）

原链接戳：【CRE专栏】最新研究：wcaJ失活的ST23高毒力肺炎克雷伯菌的毒力、适应性和碳青霉烯抗性的传播和进化