前言

同济大学附属上海市肺科医院的余方友教授团队报导了宁波市第一医院播散的25株产KPC-3酶的碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（Carbapenem-resistant Enterobacterales，CRE）。这是该产酶型的CRE在中国内陆播散的首次报导。相关研究成果于2022年7月发表在国际著名期刊《Emerging Infectious Diseases》上（IF=16.126），题目为：Outbreak of IncX8 Plasmid-Mediated KPC-3-Producing Enterobacterales Infection, China。宁波市第一医院检验科陈岚、温州医科大学附属第一医院呼吸内科艾文秀、上海市肺科医院检验科周迎为共同第一作者，美国哈肯萨克大学医学中心陈亮教授和余方友教授为共同通讯作者。

研究背景

CRE导致的感染在全球范围内具有很高的流行率和病死率。自1996年首次发现以来，已从临床样本中分离出超过90余种细菌，其中，肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和阴沟肠杆菌是最常见的CRE菌种。在中国，有超过一半的CRE产KPC-2型碳青霉烯酶，而KPC-3型却鲜有报道。与KPC-2不同的是，KPC-3发生了单一氨基酸位点替换（H272Y），并对头孢菌素和碳青霉烯类抗菌药物具有更高的水解效率。

本研究描述的是产KPC-3的CRE在中国大陆医院内播散的首次报导，包括粘质沙雷氏菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、霍氏肠杆菌和奇异变形杆菌的多种细菌。作者通过药敏试验、全基因组测序、体内毒力试验、系统发育树和感染特征分析，为在中国和全球其他地区开展对该产酶型的CRE的流行病学监测与防控提供了重要理论依据。

结果

1、产KPC-3酶CRE的感染特征

2020年8月1日至2021年6月30日期间，研究者在中国华东地区一家三级医院的24名患者标本中一共分离出25株产KPC-3酶的CRE菌株，其中粘质沙雷菌18株，肺炎克雷伯菌3株、大肠埃希菌1株、霍氏肠杆菌2株和奇异变形杆菌1株。

这24名患者中的23人曾入住所在医院2号楼和3号楼的病房（每栋楼均设置有一个ICU病房）（图1A），其中有18人感染了产KPC-3的粘质沙雷菌。大多数患者在同一时间共用同一病房，尤其是住在ICU病房里的患者。两栋楼之间由人行天桥相连。每天医务人员、患者、访客和便携式医疗设备的频繁流动为楼内和病房之间病原体的院内传播提供了诸多机会。

这些患者的平均年龄为72岁，其中男性占比79%，大多数患有严重的基础疾病（如2型糖尿病、高血压、低蛋白血症和脑梗塞等），使用过β-内酰胺类抗菌药物治疗（如哌拉西林/他唑巴坦、美罗培南和头孢哌酮/舒巴坦等）和侵入性操作（如呼吸机、深静脉插管和导尿管等）。此外，大多数患者住院时间为8-462天，其中有6名患者住院时间超过半年（图1B），有3名患者在住院期间死亡。

2、抗菌药物敏感性和碳青霉烯酶灭活试验

研究者对25株临床分离株进行18种抗菌药物敏感性检测，结果显示，所有分离株对包括碳青霉烯类在内的所有β-内酰胺类抗生素均表现出高度耐药性，但对阿米卡星、庆大霉素和头孢他啶/阿维巴坦（除CG2126外）保持敏感。之后通过改良的碳青霉烯酶灭活试验证实，所有的25株临床分离株均能产生碳青霉烯酶，并均能检测到bla_KPC-3（或bla_NDM-1）耐药基因。

3、产KPC-3酶CRE的基因组系统发育分析

研究者首先将产KPC-3粘质沙雷菌基因组与美国NCBI RefSeq数据库中的748株粘质沙雷菌基因组的组件进行了比较。结果显示，共有73株来自中国。核心基因组树显示，18株产KPC-3的粘质沙雷菌株可形成一个单一簇，并且在系统发育上与另一个含有44株菌株的簇接近，该簇主要为产KPC-2的CRE并且均来自中国（图2）。

进一步的核心单核苷酸多态性（SNP）距离分析表明，这18株粘质沙雷菌平均相差7个核心SNP，表明为克隆播散（clonal expansion）。它们与来自中国的KPC-2簇菌株平均相差7400个核心SNP，与来自中国的其余菌株平均相差45082个核心SNP，表明这18株产KPC-3的粘质沙雷菌属于一个独特的克隆，这与上述的核心基因组系统发育的分析结果一致（图2）。三株携带bla_KPC-3的肺炎克雷伯菌分别为ST65和ST967。两个K2 ST65菌株分离自同一个患者，属于典型的高毒力肺炎克雷伯菌克隆。

4、bla_KPC-3由IncX8质粒携带

研究者首先将两个经典的表达bla_KPC-3的质粒pCG2111-KPC-3和pFK3112-KPC-3完全测通。结果显示，质粒pCG2111-KPC-3全长41852 bp，平均G+C含量为46%，具有57个预测的开放阅读框，其中bla_KPC-3是唯一完整的抗菌素耐药基因。经比对，质粒pCG2111-KPC-3、p13190-3（2013年从ST392肺炎克雷伯菌中分离得到）和p15WZ-82_KPC（2015年从ST595变栖克雷伯菌中分离得到）几乎相同。此外，bla_KPC-3（在pCG2111-KPC-3质粒中）和bla_KPC-2（在p13190-3和p15WZ-82_KPC质粒中）基因均由保守的Tn 3转座子携带。三者之间的区别为：首先，pCG2111-KPC-3质粒携带bla_KPC-3，而另外两个质粒携带bla_KPC-2；其次，p13190-3和p15WZ-82_KPC质粒在复制基因上游有8个长度为22 bp的重复子（iteron）拷贝，而pCG2111-KPC-3质粒只有7个拷贝，缺少的1个重复子序列为AAACATGATGATAAATGCGAAT（图3和图4）。

pFK3112-KPC-3质粒更小，全长21888 bp，平均G+C含量为48%。它与pCG2111-KPC-3质粒携带相同的IncX8复制子，并包含36个预测的开放阅读框。与pCG2111-KPC-3质粒相比，pFK3112-KPC-3质粒有一个19964 bp的缺失，两侧是序列为GCATC的5 bp重复序列。

然后研究者以pCG2111-KPC-3和pFK3112-KPC-3为参考序列，并使用Geneious Prime 2020从剩余的23个表达blaKPC-3的菌株中重建IncX8质粒。结果显示，粘质沙雷菌、大肠埃希菌、霍氏肠杆菌、奇异变形杆菌和K2 ST65肺炎克雷伯菌分离株携带pCG2111-KPC-3样质粒，大肠埃希菌分离株（CG2126）携带pFK3112-KPC-3样质粒。

接下来，研究者以5株粘质沙雷菌和2株K2 ST65肺炎克雷伯菌为供体，大肠埃希菌EC600作为受体进行接合试验。结果显示，上述供体菌中的bla_KPC-3质粒均已成功转移至受体菌中。脉冲电场凝胶电泳（PFGE）的结果显示，所有7个转导结合子只有1个质粒，大小为42 kb（图5），随后的抗菌药敏试验结果显示，受体菌株已建立对碳青霉烯类抗菌药物的耐受性，进一步表明bla_KPC-3质粒转移成功。

5、头孢他啶/阿维巴坦体外诱导耐药试验

经1/2 MIC浓度的头孢他啶/阿维巴坦诱导筛选后，22株产KPC-3的分离株（除2株粘质沙门氏菌外）均产生了耐药性（MIC>16/4 μg/mL），耐药率高达91.7%。相同条件下诱导产KPC-2的分离株，仅有1株对头孢他啶/阿维巴坦产生耐药，耐药率低至4.2%，明显低于KPC-3的诱导耐药率菌株（P<0.05）。这一结果进一步表明，产KPC-3的菌株更易对头孢他啶/阿维巴坦产生耐药。

6、用产KPC-3的高产毒K2肺炎克雷伯菌构建大蜡螟感染模型

大蜡螟幼虫被感染20小时后，携带blaKPC-3的ST65肺炎克雷伯菌和高毒力肺炎克雷伯参考菌株ATCC 43816的死亡率为100%，显著高于感染非产毒肺炎克雷伯参考菌株后幼虫的死亡率（P<0.05）。结果表明，携带bla_KPC-3的IncX8质粒的K2 ST65肺炎克雷伯菌具有高毒力（图6）。

小结

该研究首次报道了中国内地由产KPC-3的CRE引起的医院感染暴发。通过全基因组测序分析得知blaKPC-3耐药基因由IncX8质粒携带，该质粒表现出较高的接合效率，并可通过克隆播散在不同种属的肠杆菌科细菌中进行水平传播；体内试验的结果证实，携带blaKPC-3耐药基因的IncX8质粒的ST65 K2肺炎克雷伯菌具有较高的毒力；头孢他啶/阿维巴坦体外试验表明，产KPC-3的菌株更容易产生耐药性。总之，全面分析各感染病例的时空特征，及早对分离的流行株进行深度测序，并根据检测结果积极调整监测重点的防控策略对于应对医院感染的暴发至关重要。