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下面我与大家分享我们团队研发的一项关于病原致病情况的实用小工具，我们一起来看它是怎样快速解读mNGS报告的。mNGS在近些年进展非常迅速，短短5年来，它的临床应用越来越多。无论是感染科、呼吸科还是检验科，各类专家共识在不同维度尝试通过mNGS规范临床诊疗。因此正确地认识这项技术，并且合理的应用于临床，是我们亟待解决的一个问题。
关于mNGS需要了解的基本概念
首先我们需要了解一些关于mNGS的基本概念。NGS是高通量测序，是一种可以同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。m指宏基因组（metagenome），是标本中全部生物（人、物种）基因组的总称。mNGS指对标本中的全部生物基因组进行测序。物种组（Microbiome）指某一个系统、生态环境或特定区域中全部物种的总和。生物医学领域常常是特指存在于人体特定环境中全部物种遗传物质的总和。例如，人体的肠道物种组是人体肠道全部物种遗传物质的总和。而在整个标本中的确会存在环境物种、人员物种，还有微生物物种。
另外还有一些mNGS报告中存在的关键信息，这也涉及到我们在解读时存在的一些问题。
读长一般指测序仪单个测序反应所得到的碱基序列。读长长度指该碱基序列的碱基数。读长数量指测序获得的碱基序列的数量。因此读长会受到病原体的大小、数量等方面的影响。一些公司的检测报告会基于读长有一个分解，于是就有了序列数（RPTM），它是每一千万条测得序列中包含的阳性序列条数。另外，深度、覆盖率、相对丰度也是在解读报告中关键的信息。如果测序的深度越深，那么检出碱基的可信度越高。覆盖度越广，病原体所占基因组的比例也越高。相对丰度越高，表示该物种所占比例越高。在质量控制分析中包含碱基质量分布图，它能够帮助我们去判断质控。
（王辉, 等. 宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识. 中华检验医学杂志, 2021, 44(2): 107-120.）
免疫抑制患者肺炎病原学特点——多样，混合
如今的肺炎或重症肺炎临床救治困难之一就包含病原诊断困难，因为无法明确病原体而导致在临床救治中的难度。
目前我们收治的患者越来越多，大多是一些免疫抑制的患者，而在这些患者中，可能会存在多样性、混合性的感染问题。我们在解决这样的问题时，不是像单一病原体致病那样去分析，而需要分析对于多种病原共存的宿主，应该如何去评估病原体的价值。
免疫受限宿主病原检查的复杂多样性
指南告诉给我们，对于这样的宿主，如果想明确病原就需要去兼顾可能的病原体，进行一些针对性的检测，不是广覆盖或者盲目的做所有检查。但要做到更加精准的、有针对性的检查似乎有困难，并且由于免疫受限宿主标本获取困难，而导致在很多检查中无法去获取标本。像血培养、鼻咽拭子、尿抗原等检测是比较容易做的，但如果做一些灌洗液的分子生物学PCR就不是件容易的事了。
常规临床微生物检验——不同的病原，合适的标本，恰当的方法
常规微生物检验遵循的原则就是针对不同的病原体，应该用合适的标本以及恰当的方法来发现它们。比如针对某些病原体，用快速染色的方法可以快速精简的提供线索甚至诊断，如说抗酸染色、弱抗酸染色、墨汁染色、硫胺、六胺银染色。荧光染色则对于真菌的识别率比较高。我们过去更加倚重的是培养技术，但是做培养是比较难的，既需要与临床微生物的沟通，也需要有目的的送检相应的培养基，另外它的耗时也比较长。所以目前核酸检测的应用越来越多，而核酸检测也受限于在某些医院开展有困难。虽然在新冠肆虐之后，医院开展分子生物学检测相对容易，但是能具备通过分子生物学进行全面呼吸道微生物检测的机构并不是非常多。而像支原体、衣原体、军团菌、结核杆菌等这些难培养的特殊病原体，用分子生物学检测是比较合适的。
mNGS报告内容与解读
我们期待的是不仅能够检测出哪种病原体的存在，还希望能够了解这种病原体的严重程度、药敏结果以及如何选择治疗药物。传统微生物的检测是用不同的方法去发现不同的病原体。而现在有了mNGS，它的报告中会包含患者的信息、标本信息、检测结果、丰度总结、可疑定植物种信息等，对于病原体的简单分析是基于序列数、覆盖率、丰度等因素。
还有一些公司的报告中包含耐药基因和毒力基因的检测以及背景中病原体的介绍，还会包含质控的信息。而这个报告是单纯的第三方检验机构出具的，它对微生物的检测有自己的解读方法，但并不能够完全解释临床现象。
在解读的流程中，由于报告的解读更多是来自第三方机构，所以我们会通过质控证明这份报告的合格性。再通过阳性序列，无论是Reads数或是RPTM的结果，根据不同的结果，不同病原进行相应的检测而得到结果。
对于如何区分定植，它往往是通过临床经验，依赖于数据库中可能定植与否的结论。而阳性序列的质量通过丰度、覆盖、整体的分布情况来出报告。 所以这样来自于公司的报告解读，虽然报告合格，但是应用于临床还比较困难。
mNGS技术广泛临床使用还需要很多工作
当前的困惑是mNGS在临床的使用越来越多，但是很多时候需要做更多的工作来解读报告。传统的微生物解读和检验的过程似乎相对容易，比如血培养、痰培养、真菌培养等，它的难度在于微生物检验的难度，对于病原体的送检需要一个强大的微生物平台。我们既希望它的检测速度能更快，又希望它能出具药敏结果。
mNGS技术的提高，缩短了检测的时间，简化了标本处理的流程，能够覆盖更多的病原体，而且能提供一些基因方面的耐药性和毒力的检测。所以它的优势是更便捷。但是它并没有在微生物解读报告中体现更多的优势，需要临床医生具备一定的微生物知识才能够很好的解读这个报告。
临床医生思考：感染性疾病病原诊断
临床医生对于传统的微生物检测和mNGS有不同的考量。对于传统检测的困惑是不知如何送检，从何怀疑患者的病原种类。如今有了mNGS，送检标本后能够更快的得到报告，再做微生物结果的分析相对容易。
所以临床感染性疾病病原诊断的思维发生了变化，以前是以症状来判断患者是何种病原体感染，再根据所做的微生物检测结果来验证是否是相应的病原体。现在则大不一样，只要怀疑感染就可以直接送标本进行mNGS检测，得到结果后再去分析微生物报告。这个变化也更加强调了对于解读报告的重要意义。
怎样结合临床解读报告是我们目前所思考的。从标本的角度来说，无菌标本检出病原的可能性更大。但如果单纯从病原的角度来说，对应标本的常见病原，比如检测出肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、肺孢子菌等，临床医生有经验，可以做出判断。但是如果出现少见的病原时，就需要结合文献去了解这样的病原在感染部位中致病的报道如何，需要临床医生具备文献检索的能力。
绝大多数微生物都是条件致病菌。如果出现一些机会性致病的物种，这种病原体的致病与否，与宿主的免疫状态有关，临床医生需要进一步的检索文献，不仅要了解病原，还要了解这个病原在这样的人群中是否有致病的报道。另外医生还应该知道定植的问题，在解决致病的问题后，还要清楚这样的病原体在哪种情况下会存在定植的报道。还有一些病原体从来没有过阳性结果，但临床仍然高度怀疑感染时，在这种背景之下需要在公司中找到原始物种，再去翻阅原始物种检测出的病原体，再靠临床经验去回答这个患者的感染与病原体检出是否有关联。这对临床医生的要求似乎更高了，既要知道临床特征，又要了解物种，还要具备文献检索能力，还要知道这个病原体用什么药更合适。因为原来都有药敏，可以直接看药敏报告，但现在只有一个病原菌的结果，还需要再查文献，确定什么药物对这样的病原体有效。
临床医生如何看待这个报告——检出一定致病？
下面的病例是一个老年女性患者。
患者胸部CT右肺有一些结节影，双肺还有一些磨玻璃影，外周血EBV的DNA的EB病毒的载量是很高的，我们怀疑这患者是肺炎，于是送了灌洗液的NGS检测出的两种病原体载量最多的是单增李斯特菌和表皮葡萄球菌。这时如果医生不具备微生物知识，又没有与临床很好的契合，很容易会认为这是单增李斯特菌和表皮葡萄球菌引起的肺炎，而且检测出非常多的病原体，会认为是混合感染，进行抗菌、抗PCP的治疗。
如果这样就陷入了误区，盲目的认为检测报告的病原体就是致病的病原体，没有查文献也不了解这种病原体。但实际上这个患者肺上的浸润仅仅是个炎性渗出，它检出的这两种病原体都不是已知报道的肺炎的病原体，所以并不能解释肺上的问题，而这个病人发热的本源是成人still病，是外周血EBV的感染。肺上的问题并不可能由这两种病原体引起。这样的结论怎样去获得？医生需要查文献，需要具备微生物学知识。
不了解的病原菌怎么判断价值？
如果真的出现了不了解的病原，如何判断价值？我们来看下一个病例：
于某，38岁女性， 反复发热伴胸痛8月余； 影像学显示脓胸，包裹性积液； 普通微生物培养显示肠球菌，应用氨苄西林舒巴坦治疗，病情有好转，但仍间断咳黄痰； 患者存在先天性免疫球蛋白缺乏，IgG及IgM仅正常人1/3； 给予米诺环素治疗有好转。
患者脓液标本NGS送检，检测出大量的人形支原体。人形支原体很少在肺部致病，但是对于这样免疫缺陷患者会不会致病？查文献后会发现的确在免疫缺陷人群中人形支原体有可能会致病，于是在这个背景之下，给予米诺环素的治疗才会好转。所以医生既要了解微生物学知识，又要检索文献或查阅书籍。这样的方法耗时长，结果不全面，又没办法与临床结合。
一种呼吸道病原检索工具
> 原理介绍
基于上述的困境，我们开发了一种病原致病性报道的工具。下面是原理介绍：
1、根据第11版《Manual of Clinical Microbiology》中的物种（包括细菌、真菌、病毒）制定病原物种列表。
2、在PubMed中检索病原物种相关文献：
3、选取一部分文献进行人工标注。标注人员文献是否是致病报道，标注患者人数、年龄、性别、免疫状态、标本类型
4、使用机器学习模型标注另一部分文献，标注内容与人工标注相同
5、汇总人工标注和模型标注的文献构成「呼吸道病原物种数据库」
6、基于数据库搭建病原检索工具
所以背景中我们要了解微生物学知识，而知识来自于一部分的人工标注，用人工标注的经验去建立学习模型，结合到一起构成一个呼吸道病原物种的数据库。而这个数据库靠我们去阅读文献。去阅读整篇的文献我们现在还有困难，所以我们通过标题和摘要判断目标物种是否致病，并标注被感染患者的性别、年龄、免疫状态及预后。通过获取相应的标本内容，来解读这样的病原是否致病。
比如我们以下图中的病原来判断这个物种是不是呼吸道的致病原，从摘要中告诉给我们这是一个肺炎致病菌，而患者信息摘取的机器学习来自于年龄、性别、标本类型。
> 使用方法
这个工具在CAP-China的网站中可以直接去检索，从病原检索入口进入，可以在搜索框中直接输入病种名称，无论是英文还是中文都可以。检索之后会出现相应的信息。
下图展示了病原检索工具的检索结果：
1、搜索结果页面提供了「高级检索」功能，可以设定符合患者临床特点和标本类型的筛选条件
2、搜索结果页面显示了符合条件的结果数量，每条结果包含了目标物种的中英文名称、患者信息（性别、年龄、数量）、免疫状态、标本信息（证据等级）、原文链接、发表时间
3、应用实例：如mNGS报告了大肠埃希菌，通过在「高级检索」中设定患者信息（假设患者免疫状态为「抑制」、年龄为「18-65岁」）、证据等级（假设为「BALF」），搜索出了一篇相关的报道，为大肠埃希菌可能是导致此患者呼吸道感染的致病菌提供了文献证据。
检索出的文献和信息包含病原信息和患者信息，患者信息包括年龄、性别、数量。数量是指样本量是个案还是回顾性的多样本。如果报道了大肠埃希菌，我们会发现在免疫抑制人当中，在年轻患者中（18-65岁）。如果用BALF液检出了大肠埃希菌，可以判定这是一个感染的病原体。
> 证据等级
证据等级是文献中用于检测病原的标本类型，证据等级的高低反映了我们对于这种类型的标本中检测出的物种是病原的信息。我们认为最高等级的标本来自于无菌体液的标本，比如手术取样、经皮活检、尸检标本，这样的病理学和病原学的证据是最好的。二类的标本与一类标本相同，但并不是病理的证据。三类的标本是无菌体液中的血培养、胸腹水、尿抗原等标本。四类的证据是来自于BALF或气管镜活检。五类的证据就是痰标本。六类的证据是分子技术。证据等级也可以体现标本的情况，标本质量的高低也作为判断患者是否感染的一个依据。
该工具仍存在的局限性——相信循证是前提
目前这个工具还有一些局限性。它首先应该是基于临床医生对循证的认可，不是找出病原凭经验判断是否存在感染。我们的限制因素来自于技术条件和文献版权的限制，它的局限性表现在以下几方面：
（1）为了高通量且全面地检索文献，同时由于文献全文无法批量获取，因此我们仅通过文献的摘要判断物种是否为呼吸道病原，这可能导致部分信息的缺失或误判。
（2）我们仅使用了PubMed数据库，没有考虑其他英文数据库（如Embase、Cochrane、OVFT等）或者其他语言的数据库（如中国生物医学文献数据库、知网等），因为其他英文数据库缺乏如PubMed的大批量检索的接口，而对其他语言的文献标注需要训练新的自然语言处理模型。
（3）临床上判断一个微生物是否是呼吸道感染的致病菌时，除了参考此微生物的致病报道，还要考虑实际临床情况。我们的数据库只收录了微生物在呼吸道中的致病报道，加入微生物的定植报道可能会更好地帮助临床医生进行决策。
但不管怎么样，此工具是建立在循证基础上的，结合文献检索、微生物学书籍以及我们已知的证据来给大家的回答。
mNGS目前无法取代传统微生物检验
但是我们想强调mNGS目前还无法取代传统微生物检验。测序技术是现代微生物领域的重要突破和补充，但不能够也不应该取代传统微生物。比如形态学之于真菌，就像我们开始说到的涂片技术，看到丝状真菌就可以判断是毛霉菌。再比如说抗酸染色之于结核，有一个这样的病例，临床上一个老年男性患者送检标本做各种检查最后结果都是阴性，最后通过微生物检验找到了几根抗酸杆菌就得到了明确诊断。
憧憬——思考mNGS在下呼吸道感染领域应用
有了mNGS技术，我们也希望能与各位呼吸领域同道一同去思考它在下呼吸道感染领域的应用，做更多的事情。比如如何排除定植菌的干扰这样的问题？ROC曲线、相对丰度对病原判定的意义是什么？生信问题-根据Reads如何确定病原？复杂混合感染的情况下如何分析？现在我们只能一个病原一个病原去检索，未来是不是能作为混合感染的一个工具去开发？一系列问题亟待解决，希望有更多维度的参数去嵌合到我们现在的工具中来回答这些问题。
另外我们有已知的微生物检验平台，mNGS只是对传统微生物检验起到增益的效果，并不能代替传统微生物。
对于病毒病原判读工具也有一些思考，我们目前报告的方式是通过病原来判断是否致病。但是这个维度还比较少，现在只有来自于宿主的信息和已知的文献报道。如果将临床特征、影像学、血清学嵌合进去，采用多个指标，构建更广阔的机器学习决策树模型，来提高准确率。
未来还要思考mNGS如何获益的问题。我们的获益是单纯局限在能不能检出病原，还是这样的检测技术以优化抗生素的使用、降低病死率、缩短住院时间、减少住院不良事件、减少花费来作为获益目标，这是需要我们认真思考的。
检出病原仅仅是第一步，能够指导临床决策，能够影响抗生素的使用，真正影响病死率，才是我们未来核心问题。今天与大家分享这样一个报告，介绍我们自己研发的小工具，是希望我们呼吸感染亚专业对未来的思考能够更加集中在对报告的解读上。这个工具的确减少了我们文献检索和少见病原的困难。我们做了一小步的探索，希望未来有更多的结合临床特征、影像学和实验室检查的综合思考。
专家介绍
王一民
科主任助理，就职于中日友好医院 国家呼吸医学中心 呼吸与危重症医学科；兼任武汉市金银潭医院呼吸与危重症医学科主任；中华医学会呼吸病学分会 (CTS) 与美国胸科医师学院 (ACCP) 认证PCCM专科医师；中国医师协会呼吸医师分会青年委员会委员；中国医疗保健国际交流促进会临床微生物与感染分会青委副主委；2020年北京市优秀医师。主要投身于呼吸系感染和新发突发呼吸道传染病临床诊治工作，参与卫健委抗菌药物科学管理、流感防控等工作。主持并参与重大专项3项，北京市科委重点攻关项目2项，医科院创新工程1项，发表SCI论文9篇，最高影响因子12.2（ERJ）；参编或编译书籍5部；CAP-China（中国肺炎研究协作组）联合发起人。
本文由《呼吸界》编辑 孙煜然 整理自 CACP 2022，感谢王一民老师的审阅修改！