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宏基因组高通量测序（metagenomics next generation sequencing，mNGS）技术从实验室走到临床，从最初用于脑脊液和血浆样本中的病毒检测到现在广泛应用于各种宿主样本中病毒、细菌、真菌及寄生虫的检测，特别是在肺部感染性疾病中广泛应用，协助临床对于不典型病原体、苛养菌、使用过抗菌药物导致培养失败的感染性疾病的精准治疗，而且病原体的快速诊断避免了临床治疗不必要的弯路。mNGS在结核、病毒、真菌、非典型病原体感染中是一种非常有效的广谱病原体筛查方法。本文重点综述mNGS在肺部感染性疾病中的应用研究。
一、mNGS技术的临床应用进展
mNGS可同时独立检测数千至数十亿的DNA片段。mNGS不同于聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增靶点测序的方法，而是包括从初级标本中提取总DNA或RNA（通常随后转化为DNA）、片段化、文库制备和深度测序，具有无偏见测序的优点。
近年来，mNGS技术越来越多地应用于临床，直接从临床样本中识别病原体，还有助发现新的致病病原体。2005年第一个高通量测序平台建立[2]。2008年mNGS第一次用于人类感染性疾病，发现一种新型沙粒病毒[3]。2014年新英格兰医学杂志发表了一篇病例报道，1例常规方法始终无法明确诊断的14岁脑膜炎患者，最终利用mNGS证实为钩端螺旋体感染，指导临床治疗取得成功。这个临床成功案例具有划时代的意义，显示了mNGS在指导临床精准诊治感染性疾病方面所具有的巨大潜力。2019年，Metsky等[4]采用杂交捕获的设计富集目标序列，一定程度上降低了人源序列的干扰，对于未知感染，捕获同样有助于提高病原体组装率，提高检测出率和检出丰度。新型冠状病毒肺炎疫情爆发之初，常规方法不能明确病原体，只能称之为「不明原因肺炎」，后来也是采用mNGS方法，在短时间内将病原体确定为是一种新型的冠状病毒，为精准防控疫情发挥了重要作用。
宏基因组技术还可以预测抗菌药物耐药性，鉴定毒力基因，对菌株分型，特别是在检测不易培育的病原体中具有突出的价值[5-6]。目前，这一技术利用呼吸道样本、血液、脑脊液、人体组织和粪便等多种临床样本来检测感染病原体，检测分析时间可控制在24 h以内，最快为6 h[7]。近年来，这一技术在中国临床实践中得到较为广泛的应用，中国学者在这一领域发表的研究成果无论是数量还是质量都有了长足的进步。
二、mNGS在肺部感染性疾病中的应用
据2019年全球疾病负担显示，在所有年龄段综合排名中，肺部感染位列第四位[8]，而在10岁以下儿童中，肺部感染排名第二。肺部感染性疾病发病率高，病原谱广，耐药情况较为严重。临床上常规的检测手段，如涂片镜检、培养、抗原/抗体检测等存在敏感性低、相对费时、覆盖致病菌种类少等缺点。由于肺部感染病原体的多样性，传统检测手段的局限性，使得临床上超过2/3的感染性疾病最终仍无法确定病原体，导致临床不能精准用药。重症肺部感染，以及由少见病原体导致的感染尤其需要快速明确病原体。
对于不同患者，选择合适的呼吸道标本行mNGS检测可大大提高致病菌的检出率，通常是支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）>气道吸引物>痰液>咽拭子。不同的呼吸道分泌物标本中人源/环境污染序列和病原体序列的数量不同，因此选择不同标本行mNGS检测对不同病原体的敏感性存在差异，例如血、BALF标本中检测出曲霉考虑为致病菌的可能性大于痰标本。因此报告解读时也需关注到检测标本与检测出的病原体是否相符的问题。近年来，快速发展的mNGS技术越来越多地应用于肺部感染感染性疾病的诊疗中，有望实现病毒、非典型病原体、苛养菌、结核、真菌及少见病原体的快速诊断。临床也不断有研究报道mNGS在疑难或重症肺部感染中检测出病原体，指导临床由经验治疗转为精准治疗。由此，肺部感染性疾病诊疗水平得到大幅度提升。
1、肺部感染mNGS送检标本的选择
1）BALF mNGS检测在肺部感染中的应用
BALF是目前用于肺部感染性疾病诊断最理想的检测标本之一，其受口腔及上呼吸道定植微生物污染少，且人源序列少。BALF标本还可以获取细胞学、可溶性蛋白、酶类、细胞因子、生物活性介质等多种信息，因此BALF成为诊断肺部疾病的重要手段。正确规范的标本采集对临床检测有着至关重要的作用，BALF在采集时需弃去前段可能污染的部分，收集后段10 mL置塑料或玻璃管，及时送检，若不能及时送检应保存于–70℃冰箱或液氮。Chen等[9]比较了外周血和BALF标本mNGS检测对肺部感染的诊断价值，发现BALF mNGS较外周血mNGS更敏感（81.3%比25.0%，P=0.003），而二者的特异性无显著差异。Xie等[10]比较了同一患者BALF和外周血标本中病原体的序列数，发现BALF样本显著高于血样本。BALF mNGS检测在肺部感染中的价值也不断被临床研究证实[11-13]。
2）外周血mNGS在肺部感染中的应用
外周血标本不易被污染，检测结果较易判读。在一些病情复杂的危重患者中，感染部位往往难以确定，难以获得合格标本。从外周血样本中获取病原体信息是一种可能的方法，对于合并肺部感染的菌血症或脓毒症患者而言，其外周血中的病原体核酸片段多，因此mNGS检测有较好的临床价值。由于外周血中的人源序列多，几乎所有的公司检测血标本都是离心后只检测血浆，放弃细胞层，导致检测敏感性下降。有研究对78例ICU患者的血浆行mNGS和传统细菌培养分析，结果显示单纯培养组的诊断敏感性为12.8%（10/78），mNGS组的诊断敏感性为30.8%（24/78），为制定治疗方案提供了更有用的信息[14]。Blauwkamp等[15]研究了348例符合脓毒症诊断标准的患者，使用mNGS技术检测外周血中病原体，与初始血培养相比，mNGS敏感性达到93.7%（59/63），与所有微生物检测结果（包括组织和体液培养、血清学、核酸检测及血培养）相比，mNGS敏感性为84.9%（112/132）。因此，在临床考虑存在菌血症或脓毒症时，外周血mNGS检测病原体的敏感性高，临床价值大。
3）气管抽吸物、痰mNGS在肺部感染中的应用
气管抽吸物、痰液标本临床获取比较方便易行，在肺部感染中被广泛采用。但由于存在潜在的口腔和上呼吸道微生物污染，可靠性不及BALF[16-17]，但也有研究表明，在肺炎患者中，气管抽吸物采样对气道微生物群的评估类似于侵入性的微量BALF[18]。目前关于痰mNGS在肺部感染中价值研究较少，Miao等[19]的大样本临床研究分析表明在非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）感染中痰mNGS阳性率明显低于BALF，而在其他细菌、真菌感染中无显著性差异，在某些特殊病原菌感染中，BALF检测优于痰液。
4）其他标本mNGS在肺部感染中的应用
在某些情况下，咽拭子、肺组织、胸腔积液也作为mNGS检测的标本，例如高度怀疑病毒感染时常采用咽拭子，通常为上呼吸道感染或肺部感染合并上呼吸道感染。肺组织mNGS检测可用于真菌、结核等特殊病原体感染。Li等[20]应用mNGS检测了20例肺部感染患者肺活检组织中的病原微生物，证实mNGS检测肺活检组织较培养法和组织病理法在诊断时间和灵敏度上有明显优势，特别是苛养菌、真菌及结核分枝杆菌感染。侵入性取样活检是侵袭性真菌感染诊断金标准，在行肺组织病理检查时，可同时送mNGS，为特殊病原体感染提供快速有价值的诊疗信息[21]。胸腔积液mNGS检测临床报道案例较少，可用于存在胸腔积液特别是脓胸的患者。
对于肺部感染性疾病，根据患者的不同情况，往往选取不同的临床样本行mNGS明确病原体，取材的一个重要原则是获取感染部位的标本，在患者可耐受的情况下通过优选样本类型（肺组织、BALF>气管抽吸物>痰液>咽拭子）提高呼吸道病原学检出率，临床医生通常将BALF作为mNGS用于肺部感染性疾病诊断中的最佳标本。当前对于不同标本mNGS检测在不同肺部感染性疾病中的研究都为小样本研究，尚需要大样本临床研究进一步证明。
2、mNGS在不同病原体所致肺部感染中的应用
1） mNGS在肺分枝杆菌感染诊断中的应用
结核病是全球十大死亡原因之一。尽管已有有效的治疗方案，但仍面临着快速和可靠诊断的问题。由于肺结核的非特异性症状和体征常与常见肺部感染重叠，可能会延迟肺结核的诊断，增加肺结核相关死亡。临床迫切需要快速和无假设的诊断方法，以便在诊断过程的早期阶段准确区分肺结核和其他常见肺部感染。目前，利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（GeneXpert MTB/RIF，以下简称Xpert）已被世界卫生组织认可为结核疑似患者的初步诊断方法。Shi等[17]对比培养、抗酸染色、Xpert等临床检测方法，证实mNGS对BALF样本结核诊断的敏感性为47.9%，与Xpert（45.8%）和培养（46.8%）相似，但远高于抗酸染色（29.2%），研究还发现mNGS对于肺结核患者的混合感染（如合并真菌、细菌）较常规检测手段具有明显优势。上海复旦大学的大样本研究中所分离的257种微生物中，结核分枝杆菌（53/257）是最常见的病原体，mNGS检测结核分枝杆菌的阳性率显著高于培养[19]。目前国内多个研究显示BALF mNGS的敏感性优于传统培养法和抗酸染色，而与Xpert法相似，这可能与分枝杆菌的细胞壁非常坚硬、难以破壁有关。因此，若怀疑分支杆菌感染时，可采取常规方法以外的破壁方法，即使在检测报告中序列数较低，也应该考虑致病微生物的可能。mNGS检测在时效性及合并感染时也明显优于其他检测方法，将mNGS与培养或Xpert法相结合在结核病的临床诊断中具有较好的价值[17, 22]。
近年来，NTM的发病率逐年增高，由于该病的临床特征与肺结核相似，菌种的培养需要特殊的培养基、特定的培养温度以及延长培养时间，常导致误诊和漏诊，延误治疗，严重威胁人类生命和健康。mNGS可以实现NTM菌种的快速鉴定[23]，为NTM肺病提供及时精准的诊疗指导。但由于NTM广泛存在于环境中，特别是有水的环境，故mNGS检测NTM阳性结果的解释应慎重，需要排除污染的可能。
2）mNGS在下呼吸道病毒感染中的应用
既往常规病毒诊断是基于PCR技术，可检测病原体的种类非常有限，容易遗漏临床不常见的、新的病毒[24]。近年来，不断的有报道通过mNGS技术发现罕见甚至新发病原体，如人类鼻病毒B91感染肺部[25]、新型冠状病毒肺炎等。目前为止，已有研究利用宏基用组学研究儿童急性呼吸道病毒感染的全面图谱，有助于呼吸道疾病的检测和预防[26]。van Rijn等[27]分析了成人慢阻肺急性加重患者的病毒感染，发现与PCR相比，mNGS诊断的敏感性和特异性分别为96%和98%（23/24和1093/1120），证实了mNGS对呼吸道病毒的半定量检测具有高灵敏度和特异性，且mNGS较高的阴性预测值有助于排除致病性呼吸道病毒感染，从而协助临床决策。也有研究报道mNGS对常见呼吸道病毒诊断的敏感性低于PCR[24]，这可能与mNGS检测的内部程序流程有关。对于高度怀疑病毒性肺炎且病情持续进展的患者，mNGS可为临床诊疗进一步提供有利线索。
3）mNGS在肺部真菌及非典型病原体感染中的应用
目前mNGS在肺部真菌及非典型病原体的研究往往为个案报道或混合感染，临床常规检测手段检测不出多种苛养菌和特殊病原体，而mNGS协助临床对耶氏肺孢子菌[28-29]、尖端赛多孢子菌[30]、曲霉[31-32]、鹦鹉热衣原体[33-34]、嗜肺军团菌[35]感染肺部的诊断，最终通过更改治疗方案协助临床治疗。Hong等[21]在9例患者应用mNGS检测血标本有助于明确不能获取活检病理的疑似侵袭性真菌感染患者的诊断。
上海复旦大学附属中山医院的关于mNGS应用于感染性疾病的诊断性能的大样本研究中，呼吸系统感染占感染性疾病73.5%（255/347），研究得出mNGS诊断感染性疾病的敏感性和特异性分别为50.7%和85.7%，优于培养法，尤其是结核分枝杆菌、厌氧菌和真菌，且受先前抗菌药物暴露的影响较小[19]。要而言之，mNGS在结核、病毒、真菌、非典型病原体感染中是一种非常有效的广谱病原体筛查方法，病原体的快速明确避免了临床治疗不必要的弯路。
3、mNGS的临床适应证
对于免疫缺陷患者，肺炎是其发病和死亡的主要原因之一，早期发现病原菌予适当的抗菌治疗和改善临床结果至关重要。Pan等[11]报道了mNGS对免疫缺陷社区获得性肺炎(community acquired pneumonia，CAP）患者微生物学诊断中的应用，研究表明mNGS技术在检测条件致病菌和混合感染方面具有显著优势。在一项mNGS用于免疫低下重症社区获得性肺炎（severe community acquired pneumonia，SCAP）的研究中[36]，与免疫正常组相比，免疫低下组更易合并感染，mNGS是检测免疫缺陷SCAP患者混合感染和个体化抗菌药物治疗的有用技术。有研究对108例接受皮质激素治疗的疑似感染患者的样本同时进行mNGS检测与常规微生物检测，基于mNGS检测结果调整抗菌药物方案的患者治疗成功率（81.8%）显著高于经验性使用抗菌药物的患者（52.6%），且mNGS检测结果不受免疫抑制程度影响，为免疫抑制患者的抗菌药物治疗提供了有价值的信息[37]。
2020年我国一项多中心329例关于BALF mNGS在成人SCAP的价值研究显示，mNGS相对于常规检测的高检出率有助于SCAP致病菌的早期识别，还可用于分析SCAP的致病菌分布情况[38]。Xie等[39]回顾性研究发现使用mNGS与降低重症患者病死率独立相关（16.67%比42.3%）。mNGS是明确重症肺炎引起急性呼吸窘迫综合征病因学、提高诊断准确性和预后的有价值的工具[40]。Fang等[41]在BALF mNGS对呼吸机相关肺炎的诊断价值研究中发现，使用BALF检测mNGS可提高呼吸机相关肺炎患者细菌鉴定的敏感性和特异性, 在检测病毒和识别混合感染方面显示出明显的优势。以上研究表明，mNGS在重症肺炎、免疫缺陷患者的肺部感染及呼吸机相关肺炎等肺部感染性疾病中的应用可明显提高感染性疾病病原体的早期诊断。Qian等[24]研究了100例肺部感染患者呼吸道标本mNGS对肺部感染的诊断价值，提出将mNGS作为传统方法的补充，有助于提高呼吸道感染病原体的检出率，当怀疑有混合或罕见病原体感染时，免疫功能低下者和（或）病情严重需要紧急治疗者，建议及时使用mNGS。
由于开展高通量测序的成本仍较高，尚不宜作为所有感染性疾病的常规检测手段。国内专家共识中指出，mNGS的临床适应证包括：临床规范经验抗感染治疗无效且常规方法不能明确病原体；重症感染或病情持续进展的感染；免疫受损患者发生的感染；慢性感染，或慢性疾病不除外感染等[42]。关于送检mNGS的最佳时机，目前还需要进一步研究。
三、mNGS报告解读
正确的解读同样是保证mNGS优势的关键，临床医生解读报告时必须明确序列数、相对丰度与鉴定置信度等重要参数的意义。阳性结果有助于明确感染病原体，阴性结果亦可用于排除感染性疾病。mNGS检测结果需与临床表现、传统检测及检查结果相结合作出解读，根据不同情况可分为以下几种类型：（1）当mNGS检测结果与患者临床表现及相关实验室结果相符合，可根据结果指导临床抗感染决策。（2）当患者mNGS检测结果阳性，且与临床表现相吻合，但未获得其他实验室检查结果证据支持，可进一步完善或重复传统病原学检测，并同时启动治疗。（3）当患者仅获得mNGS阳性检测结果，但与临床表现和（或）其他实验室检查结果不相符，此时可行PCR检测进一步验证，同时结合患者临床表现综合分析，不能仅根据mNGS检测结果进行病原学诊断。（4）当mNGS检测结果阴性，而其他实验室检查结果为阳性，需结合患者临床表现及其他辅助检查综合分析，若为假阴性，在必要情况下可考虑重复mNGS检测；若为真阴性，则应停用抗菌药物。
四、mNGS前景与挑战
mNGS最大优势在于快速精准、高通量检测，为早期目标抗感染治疗提供证据支持。另一个关键优势是测序数据可以用于其他分析，例如微生物组特征分析，对特定病原体进行耐药基因检测和毒力因子分析[43]，辅助临床耐药菌的诊断及艰难梭菌的管理与治疗，以及通过RNA测序对人类宿主的转录组分析。国内有研究根据肺部感染患者和非肺部感染患者有不同的免疫应答，可能有不同的免疫相关转录组，比较了从BALF获得的宿主转录组，以寻找肺部感染患者的预测标志。分析显示，肺部感染组HLA-DRB1显著上调，而TRAV32、MIR4270、PSME2和GAPDH显著下调，研究还分析比较了细菌和病毒肺部感染组、结核和非结核组的转录组，不同感染组差异表达基因不同，由此得出mNGS结合宿主转录组分析有望成为肺部感染临床诊断的有力工具[44]。
2020年自然杂志的一篇文章介绍了应用纳米孔宏基因组学快速诊断下呼吸道细菌感染的方法，即应用皂苷裂解宿主细胞可有效从临床呼吸样本中去除高达99.99%的宿主核酸，结合纳米孔测序可在6 h内识别病原体和抗菌药物耐药性基因[7]，纳米孔技术可以通过可扩展、便携式和云兼容的管道以及添加引物富集原基因，实现快速的高分辨测序。尽管食品及药物管理局已经为NGS感染性疾病检测的临床验证提供了一般指南，但关于临床实施mNGS检测并没有明确的建议，也没有提到具体要求。目前提取平台选择、核酸提取方法、污染问题（包括样品、周围环境或分子生物学试剂），仍是诊断结果可靠性的巨大挑战。感染性疾病是否有必要行mNGS检测以及检测的时机判定、不同标本类型的选择尚缺乏高证据等级的临床研究支持的统一标准，仍需要继续研究。
随着mNGS检测技术的不断发展，用于评估mNGS的临床效用和成本效益的大样本前瞻性临床试验数据将越来越多；mNGS的总成本和周转时间将继续下降；mNGS的其他优势，如纳入了人类宿主反应和微生物组数据，将不断在临床中发挥价值。综上，mNGS可以实现病原体鉴定与相对定量，耐药基因与毒力因子分析，宿主转录组学与免疫反应分析，从病原、药物、宿主三个维度推动肺部感染精准医学的发展，mNGS将成为肺部感染性疾病的有力工具。
利益冲突：本文不涉及任何利益冲突。
参考文献略。
引用本文：倪月艳, 施毅, 苏欣. 宏基因组高通量测序在肺部感染诊疗中的应用研究进展. 中国呼吸与危重监护杂志, 2022, 21(2): 142-147. doi: 10.7507/1671-6205.202109046
本文转载自公众号「中国呼吸与危重监护杂志」