要想解读出呼吸道标本真菌培养阳性结果到底是污染还是定植？亦或是感染？我们已经总结出一点：临床医生的基本功是正确地采集和运送标本。反过来看，要想提高呼吸道分泌物检出的准确率，只关乎临床医师的事吗？当然不是，关键还需要检验科的医生正确地检测标本。因此这又是衡量检验科医生的基本功。目前我们的实验室检测过程当中到底存在多少问题呢？

为什么往往检验科的报告不规范？要注意的要点有哪些？

在讲这个之前我们首先要思考一个问题：临床送去的标本有没有先判断它真的是合格的痰标本吗？因为对于痰标本，我们有很多医院，尤其是基层医院，基本上是没有质量管控程序的，因此痰标本在病原学诊断中的准确率面临巨大困难。

这里要注意到几个要点： 1.正确地判断合格的痰、尿标本；2.痰涂片对病原菌判读的意义；3.血标本培养方法的选择和结果评估；4.脑脊液标本的镜检；5.特殊染色对病原菌的识别；6.对临床医师的教育；7.其他有待完善的注意事项。

为什么说痰标本在病原学诊断中面临巨大困难？ 比如说在CAP调查里发现，有40%以上患者就没痰，你以为自己送的是痰，但很有可能送的是唾液；即使是痰，合格率也极低，唾液的几率仍然最高；哪怕痰培养阳性结果出来了，它受的影响因素太多，包括采集、运输、处理、判断的过程，前期有没有抗菌药物的应用，以及解释结果的方法等等，甚至我们加上革兰染色，最近有数据证明，只有14%的几率能辨别出痰涂片里细胞的形态，非常低。这些都是痰标本面临的困难。
因此把刚才讲到的这些特点分类做个小结：

痰标本在病原学诊断中面临的困难：

咳痰——CAP患者40%以上患者无痰

痰标本——合格率较低，甚至送检唾液

培养——痰培养阳性率受多种因素影响且影响极大，包括标本采集、运输、是否及时处理、合理应用细胞学判断标准、前期有无抗菌药物治疗、解释技能

涂片革兰染色——最新数据表明，通过革兰染色辨别1669个CAP住院病人合格标本，只有14%可辨别出主要形态类型

除了以上特点，再加上我们检验科的报告不规范。为什么这样说？大家看检验科的专家共识或者规范章程是这样规定的：比如一个涂片出来，涂片是要求微生物报什么呢？报你查到了什么。如果是阴性，就意味着没有查到；如果是阳性，必须报告细菌或真菌的形态是什么？感染染色是阴性还是阳性？它是怎么排列的？涂片有没有半定量的结果？如果有不同的病原体，它的比例如何？有没有周边有细胞学的结果？因此要非常详细地去描述。也把这部分作了一个小结便于大家参考：

涂片结果的规范报告：

必备要素

检测项目：

微生物学检查：阴性，阳性，具体描述，细菌革兰染色（形态、染色、排列、半定量、比例）

细胞学检查结果：

建议要素、注意事项

这种不规范报告让临床没法做判断，甚至有的医师连病原体的规范名称都叫不准确

可是看看我们的临床当中，我们经常收到检验科的报告是什么？我做了一张图，大概是这个意思：

比如一份细菌学的报告，告诉我们说涂片可以见到革兰阳性球菌，革兰阴性球菌，革兰阳性杆菌，革兰阴性杆菌。我为什么打这么多问号？这种报告有用吗？我要你这句话有用吗？什么菌都有，到底是哪一种占优势？都不知道；又比如检验真菌，他们给你出这样的报告：涂片可以见到真菌。有多少？是丝状真菌还是酵母菌？统统不知道。所以这种不规范的报告根本就让临床没有办法去做判断，更别提可靠性。甚至我们有的医师连病原体的规范名字都叫不准确。

关于规范病原体的名称我认为检验科微生物室医生应该率先规范。为什么？大家都知道病原体的名字起名有个过程，有的过去一直在用，但现在慢慢地规范了，有的重新认识了完全改了新的名字，临床医生可能不知道，但检验科微生物室的医生应该知道，并率先规范。比如卡氏肺孢子虫已经改为耶氏肺孢子菌，马尔尼菲青霉现在叫马尔尼菲篮状菌，而这个篮往往很多人写成蓝天的蓝，都是错的。肠杆菌科细菌应该叫肠杆菌目细菌，恙虫病立克次体应该叫恙虫病东方体，过去叫曲霉菌和毛霉菌，这个菌字要去掉，就是曲霉、毛霉，而过去我们认为毛霉的上一级叫接合菌，现在连接合菌这个名称都取消了，就叫毛霉……所以，如何去规范？从最基本的名称做起，检验科应该给临床做个表率，记住这些改变难吗？并不难。

同样，标本来了以后我们必须去判断它是否合格。大家都知道这个标准：低倍镜下观察20-40个视野，合格痰标本；上皮细胞＜10个/低倍视野；白细胞＞25个/低倍视野。可是我们又有几家医院的检验科能做到，当发现标本不合格的时候，你把它拒收，退回去？真的很少这样做。

当然，这里面牵扯到很多管理上的问题，比如说送的标本已经收费了，退回去这个费用就退不掉，怎么办？这容易引起医患矛盾。或者医生就不能再送第二次了，因为可能拿不到第二次标本了等等。但确实我们应该要有规章，那些不合格的标本，做了还不如不做。不合格的标本该退的时候，就应该要退掉。

这种信号有助于判断感染还是定植……从检验的角度区分痰标本阳性结果要从三个方向来解析

那么，从检验的角度怎么去区分痰标本阳性结果到底是定植还是感染呢？

解析一：痰标本——从检验的角度如何区分定植与感染

最简单和最直接的证据就是痰涂片

1、感染菌会导致白细胞大量增加；

2、感染早期（细菌、真菌）启动非特异性免疫因子；

3、中性粒细胞是最主要的免疫细胞，吞噬和包裹现象是反应病原菌与机体免疫系统的相关性的最重要信号，观察这一现象有助于区别是感染还是定植。

意思是什么呢？从检验的角度，痰涂片真的非常有价值。但我们的涂片又的确做得不够好，这里真不是责怪检验科医生。我们都知道，在中国，做一个痰涂片最多收费10块钱，说句实话连成本都回不来，更别说医生花了那么多的精力去看，但痰涂片确实可以给临床医生提供非常有用的信息，比如说感染，由于感染菌会导致白细胞增加和免疫反应的出现，所以非常容易从痰里看到中性粒细胞去吞噬和包裹病原体的现象，这是病原体和机体免疫系统相关性非常重要的一个信号，看到这种信号是有助于我们判断感染和定植。可是，能看到的医生并不多。

解析二：肺泡灌洗液的涂片革兰染色

1.适量BALF标本进行细胞离心，经自然干燥、甲醇固定或火焰快速固定3次，革兰染色；

2.标本质量判断以扁平鳞状上皮细胞占全部细胞比例＜1%为合格标本；

敏感度为10⁴个细胞/mL，若每个油镜视野可见1个或多个细菌，报告革兰染色形态及白细胞结果，提示此菌与活动性肺炎相关。

这一段又是什么意思呢？即使是肺泡灌洗，也可以做出涂片，当然必须是离心。那么怎么去判断它合格？它跟痰是不一样的，就是以这个细胞层里面的鳞状上皮细胞要占到全部细胞比例必须小于百分之一。如果太多，就容易受到上气道的影响。这个标准很多人并不知道，或者根本就没有做，因为临床经常做了肺泡灌洗后都找不到地方帮忙做细胞学分类，同时还要知道，看到的细胞数量要多到一定的程度才提示可能跟感染有关，比如说每毫升能超过10的4次方的细菌，或者油镜可以见到1个或者多个的细菌，加上白细胞，那么感染的几率就会大大地增加了。

上图就是解析三：真菌也是如此。直接镜检、涂片染色可以看到圆形或者卵圆形或者孢子以及假菌丝，是非常重要的判定真菌感染的实验室检查，既快又方便。但是这确实需要检验科医生要有一定的镜检的能力。比如说念珠菌属，它是酵母菌，所以既有酵母相也有菌丝相，酵母相就是芽孢，它通常见于没有症状的患者。但是如果是菌丝相，就代表念珠菌在生长，可以出现假菌丝大量地繁殖，再结合临床，往往提示它感染的机会就高。当然我们要注意，不是所有的念珠菌都有假菌丝产生，像光滑念珠菌它就不产生菌丝，不要因为没菌丝就否认它的致病性。

图中还可以看到，对于曲霉、毛霉来说，属于丝状真菌，它是一种多细胞真菌，容易形成细管，称之为菌丝，而曲霉的菌丝是粗细均匀有分隔的，毛霉的菌丝是粗壮无分隔、粗细不均的，还可以看到曲霉菌丝的分叉是呈45度的角，而毛霉是90度角，有经验的医师根据这一点就可以帮助我们判定这是不是处于感染的状态，可能是曲霉还是毛霉。

指南对于气道标本培养的推荐是「优化检测流程+结合其他检测」……结合镜检所见该如何判断？哪些最有价值？

培养结果的报告规范：

普通培养：

1、无菌部位标本培养阴性：多少天？

2、无菌部位标本培养阳性：多少天？

3、正常有菌部位标本培养，完全无菌生长

4、正常有菌部位标本培养，仅有正常菌群分离

5、正常有菌部位标本培养，1种或2种可能致病菌，伴或不伴正常菌群分离

靶向培养，重复分离株，拒收报告，注意事项

上表告诉我们，除了涂片有规范可循，培养结果的报告同样有规范可循。关于培养，微生物学也有非常明确的规范，如果发现有微生物致病菌生长，就不能只告诉临床说：有什么菌在生长。而是应该要告诉临床：合格菌的培养，如果阴性，是培养后多少天报告的阴性结果？如果是阳性，是多少天开始出现阳性的？是完全无菌还是仅有正常的菌群分离？还是有1到2种可能的致病菌？有没有伴正常菌分离的现象？这才是规范的报告。但是我们临床上经常见到这样的培养结果报告，说：培养可见真菌生长。什么时候长的呢？不知道。长多少？是丝状真菌还是酵母菌？都不知道。那这种报告对临床的诊断价值就非常有限。

上图可以看到，指南对于气道标本真菌培养的推荐是：优化检测流程+结合其他检测。其中包括要求在分子诊断工具尚未在临床实验室广泛应用之前，建议充分数量的组织和体液标本进行组织/细胞学和培养的同步监测。

非无菌标本的初始分离，如：痰，气道吸引物再在真菌专用培养基如沙氏培养基（SDA），脑心浸液琼脂（BHI），马铃薯培养基（PDA）（可加入庆大霉素和氯霉素）中培养，在30℃和37℃两种条件下培养72小时，我们会见到有一部分真菌呈双向性生长的证据。

结合镜检来看，这是鲍曼不动杆菌、奴卡菌的镜检，如果这些标本我们涂片看到了典型的鳞状上皮细胞少，白细胞多，又看到鲍曼不动杆菌这种短小的杆菌生长，就可以判定感染的几率高；如果看到奴卡菌的菌丝，就很容易判断为感染了。

又如鲍曼不动杆菌培养阳性，有3个到多个象限生长，它是定植还是感染呢？看图片里，白细胞内有大量的细菌，旁边又有大量伴随的细菌，这种培养的结果，感染的几率非常高。

上图既可以看到伴随生长的细长杆菌，又可以看到短小粗壮杆菌的吞噬现象，而培养基里有不同的菌落出现。因此很容易推断，这是一个铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的混合感染。

又如这个涂片染色未见细菌，什么都看不到，培养基里只有少量的鲍曼不动杆菌生长（仅仅一个象限）。我们本来就知道鲍曼不动杆菌是容易定植的，那就很容易判定这要么是定植，要么是污染，而不会考虑为感染。

吞噬非常重要，可以看到白细胞吞噬病原体的现象，这就提示给临床：这份标本有感染的现象。这是一个非常重要的信息。

如果要看真菌，如上图所示：我们可以看到假菌丝和芽孢，既有孢子又有菌丝，还有在高倍镜底下看到的菌丝。那么，就很容易证实这个时候培养出来的念珠菌其临床价值非常高。

如何区分「阳性」在无菌和带菌部位的意义？……下呼吸道标本培养如何鉴定？肺泡灌洗液定量培养有何意义？

注意看以下这16项关于痰涂片革兰染色结果的解释：

痰涂片革兰染色结果的解释（镜下所见——解释）：

1.＞10个鳞状上皮细胞——标本包含唾液和上呼吸道分泌物，提示标本被唾液污染，不再进行培养；

2.＜10个鳞状上皮细胞，大量多形核白细胞，存在肺泡巨噬细胞和柱状上皮细胞——提示是一个好的深部痰标本；

3.大量多形核白细胞——提示感染；

4.胞内细菌——提示感染；

5.弹性蛋白或胶原纤维、淀粉样小体和坏死的白细胞——提示感染；

6.淀粉样小体——见于迁延长时间的呼吸道疾病，如COPD；

7.粉色絮状物——提示呼吸道疾病治疗产生的雾化高渗盐水；

8.夏科-莱登结晶——提示过敏性肺曲霉病；

9.大量多形核白细胞，主要见革兰阳性球菌成对或成短链排列——可疑肺炎链球菌，应电话通知临床医生；

10.大量多形核白细胞，主要见革兰阳性球菌成堆排列——可疑金黄色葡萄球菌肺炎，应电话通知临床医生；

11.大量多形核白细胞，主要见革兰阴性双球菌——可疑卡他莫拉菌局限性肺炎，应电话通知临床医生；

12.大量多形核白细胞，主要见小的革兰阴性球杆菌——可疑流感嗜血杆菌肺炎，应电话通知临床医生；

13.大量多形核白细胞，主要见大而胖的革兰阴性杆菌——可疑克雷伯菌或其他肠杆菌目菌引起的肺炎；

14.大量多形核白细胞，大量小的革兰阴性杆菌和球杆菌，革兰阳性球菌成链排列以及其他不同形态的细菌——提示为吸入性肺炎，需在报告中特别提示，因为培养结果会显示正常菌丛生长，应电话通知临床医生；

15.出芽的酵母样孢子和假菌丝——通常提示鹅口疮或上呼吸道酵母菌感染，不是肺炎，仅当其为主要所见菌时报告；

16.其他异常结构，如真菌、分枝的革兰阳性丝状杆菌或奇特形状的细菌（可能是抗菌药物治疗的结果）——请教高级医生进行确认，可能需要进行补充实验，如改良的抗酸染色等。

这16条是《中华结核和呼吸杂志》在2011年就提出的涂片加革兰染色该如何去解释的结果。因此大家一定要对涂片认真对待，而不是简单地报一下有或者没有。

因此，镜检加培养就可以出现多种的结果，比如说涂片，如果培养阳性，但涂片什么都看不到，就提示可能污染的几率会比较高；反过来，如果是培养出来有了，但是看不到菌丝，这就提示是定植的可能性高。但如果我们培养出，涂片又有菌丝，而菌丝形态又非常一致，意思就是培养的菌和看到的菌丝是同一种，病原微生物的形态非常接近，又是多部位、多次阳性，那么它判定是感染的几率就要高得多。所以仅仅就是这些非常简单的方法，实际上就可以帮助我们解决到底是污染还是定植的问题。

当然，结果阳性的判定在无菌部位和带菌部位意义一定是不一样的。如果是无菌部位，直接就可以判断，但如果是非无菌部位，判断就需要小心得多。

对于下呼吸道标本培养的鉴定，我们对细菌感染定了一些判定标准：

1.分离的可能是寄生菌、定植菌或病原菌；

2.气管内吸出物培养＞10⁵ cfu/ml；

3.支气管肺泡灌洗＞10⁴ cfu/ml，＞5%为胞内菌；

4.带保护毛刷标本＞10³ cfu/ml；

5.使用抗菌药物后，下降一个数量级仍有意义；

6.未使用抗菌药物的，＜10⁵ cfu/ml具有较高阴性预测值。

那么真菌有没有标准呢？我们看肺泡灌洗液定量培养的意义：

1.细菌性感染，浓度阈值10⁴ CFU/mL，低于阈值浓度时，定植可能性大；高于阈值时，感染可能性大；

2.真菌性感染，目前没有BALF的诊断性阈值；

3.丝状真菌也没有阈值。但丝状真菌在呼吸道分泌物中培养出的价值远大于酵母菌属。

这里要强调一点，到底真菌培养应该是10的几次方来做阈值？这是需要我们今后不断去探索的。但是如果培养出来，涂片我们看到，培养是阳性、又是丝状真菌，总体来说它的临床价值一定是优于培养出来是一个酵母菌。丝状真菌不论是曲霉还是毛霉培养阳性时临床意义是优于酵母菌的。

专家介绍

施毅

南京大学医学院附属金陵医院呼吸与危重症医学科 教授、主任医师、博士生导师、博士后导师；美国胸科医师学会资深会员；江苏省医学会呼吸病学分会第七、八届主任委员；中国医药教育学会感染疾病专业委员会常委；中国医药教育学会真菌病专业委员会常委；中国老年医学会呼吸病学分会常委兼感染学术委员会主任委员。

本文由《呼吸界》编辑 冬雪凝 整理，感谢施毅教授的审阅修改！

本文完

排版：Jerry