引言

近日，北京大学第三医院陈亚红教授、张静副教授、刘彤副教授作为共同通讯作者，2019级博士研究生王莹作为第一作者，在Free Radical Biology and Medicine（IF：7.376）发表题为「Hydrogen sulfide alleviates particulate matter-induced emphysema and airway inflammation by suppressing ferroptosis」的研究论文。该研究着重探讨了硫化氢抗PM2.5介导的肺气肿和气道炎症的作用及具体机制，以下是全文解析。

摘要

背景：氧化还原失衡是 COPD 的重要机制。目前，关于硫化氢（H2S）对PM诱导的慢阻肺保护作用研究不足，并且，H2S能否通过阻断铁死亡和恢复氧化还原平衡发挥抗肺气肿及气道炎症的作用仍有待研究。

方法：采集人肺组织标本进行IHC染色，观察Nrf2、铁自噬和铁死亡相关蛋白的表达。使用PM（200 μg/per mouse）建立WT 和 Nrf2 敲除小鼠慢阻肺模型。NaHS（外源性H2S）提前30分钟腹腔注射。29 天后，通过 HE 和 PERLS-DAB 染色评估小鼠肺组织病理。同时，ELISA检测炎症和氧化应激相关指标和铁水平。Western blot检测相关蛋白表达。使用PM2.5刺激BEAS-2B 细胞建立细胞损伤模型，分别通过特定方法检测细胞活力、线粒体形态、炎性因子、抗氧化因子、铁水平、自噬通量以及ROS、LIP ROS、MitoROS、MMP的水平以及相关蛋白的表达。此外，V5-Nrf2过表达质粒、Nrf2 siRNA、Nrf2抑制剂ML385、PPAR-γ抑制剂GW9662、自噬抑制剂CQ、铁螯合剂DFO和铁死亡抑制剂Fer-1用于验证靶信号通路。

结果：我们发现，在COPD患者、PM暴露的WT和Nrf2-KO小鼠模型以及PM2.5介导的细胞模型中，LIP ROS、ROS、COX2、MDA等氧化因子的表达增加，而抗氧化标记物Gpx4、GSH和GSH-Px显著降低，并且存在活性铁蓄积现象。NaHS可明显抑制PM介导的肺气肿和呼吸道炎症，其机制可能与其减轻体内和体外的铁死亡改变有关。通过使用V5-Nrf2过表达载体、Nrf2siRNA和各通路抑制剂，我们发现在BEAS-2B细胞中，NaHS激活Nrf2和PPAR-γ的表达，并抑制了铁自噬标志蛋白LC3B、NCOA4和FTH1。此外，在MEF细胞进一步证实了NaHS的抗铁死亡作用与Nrf2信号的激活相关。

结论：本研究表明，H2S 通过调节 Nrf2-PPAR-铁自噬信号抑制铁死亡并恢复氧化还原平衡，从而减轻了 PM介导的肺气肿和气道炎症。

关键词：慢性阻塞性肺疾病，硫化氢，PM2.5，脂质过氧化，铁死亡

前言

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种进行性呼吸系统疾病，其特征是持续性呼吸症状和慢性气流受限。大气颗粒物，尤其是PM2.5（细颗粒物，空气动力学直径小于2.5 µm）是COPD的重要外源性风险因素。PM2.5主要通过产生大量活性氧（ROS）来激活氧化还原失衡发挥其毒性作用。氧化应激可通过激活促炎症转录、抗蛋白酶防御受损、细胞衰老、线粒体损伤、DNA损伤和细胞死亡等促进和增强气道慢性炎症和肺气肿。因此，抑制氧化抗氧化失衡对延缓COPD的进展具有重要意义。

铁死亡是一种新型的调节性细胞死亡（RCD），被定义为由致命脂质过氧化物积累引起的铁依赖模式。铁死亡细胞的死亡可以被铁螯合剂及其类似物抑制，这意味着铁是铁死亡的基本成分。铁自噬对调节细胞铁水平至关重要，一旦这种自噬过程被激活，核受体辅激活因子4（NCOA4）识别并结合铁蛋白，并从细胞质运输到溶酶体降解释放，随后增加不稳定的铁蓄积并引发铁死亡过程。Yoshida等发现，铁死亡介导的COPD中，功能失调的铁自噬引起的异常铁平衡占有重要地位。而过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）-γ途径被发现可通过调节氧化应激来抑制COPD的病理过程，且PPAR-γ信号与铁死亡存在相关性。因此，激活PPAR-γ通路、抑制铁自噬过程和进而阻断铁死亡可能是COPD防治的重要靶点。

硫化氢（H2S）是一种新型的气体递质，能以非受体方式激活细胞靶点，调节哺乳动物多种病理和生理过程。大量研究发现，H2S激活核因子红系2相关因子2（Nrf2）介导的抗氧化作用在呼吸系统疾病的进展中起着重要作用。此外，Nrf2也可能是介导铁死亡级联的关键调节因子，但Nrf2抑制铁死亡信号级联的下游具体靶点仍不清楚。考虑到这些证据，H2S对PM2.5诱导的肺气肿和气道炎症的保护作用是否与抗铁死亡有关，以及Nrf2、PPAR-γ与铁自噬在这一过程中的相互关系有待探索。

本研究详细探讨了H2S对PM2.5诱导的肺气肿和气道炎症的作用机制，以期为预防和治疗PM2.5引起的肺损伤奠定了坚实的基础。

研究结果

1、铁死亡参与了COPD的发病过程

COX2是铁死亡标志蛋白之一，通过检测人肺组织样本中COX2的表达和分布，可见与非吸烟者组相比，吸烟者组肺组织中COX2蛋白的表达增加，但无显著差异。而与吸烟者组相比，COPD患者的COX2蛋白表达显著上调。并且COX2主要表达于肺泡上皮细胞和巨噬细胞中（图1）。此外，通过对铁自噬蛋白进行IHC染色（图1），我们发现，与非吸烟者组相比，吸烟者组NCOA4和FTH1的表达增加。而与吸烟者组相比，COPD患者NCOA4和FTH1的表达下调。并且NCOA4和FTH1的表达主要分布于肺泡上皮细胞和巨噬细胞，其中巨噬细胞的表达变化最为显著。铁死亡及铁自噬可能参与了COPD的进展。

Fig.1. Ferroptosis and ferritinophagy are involved in human lung tissues.

2、NaHS 明显抑制WT模型小鼠的铁死亡，但对Nrf2敲除模型鼠作用降低

用PM建立小鼠模型，结果发现(图2)，模型小鼠发生显著肺气肿及炎症改变，而NaHS治疗显著减轻PM介导的肺损伤，而NaHS对Nrf2敲除模型小鼠的损伤保护作用明显降低。以此推测NaHS通过Nrf2信号通路发挥抗PM介导的肺气肿和气道炎症作用。而通过测定MDA、GSH和GSH-px等氧化应激指标，肺组织内铁分布及铁含量，我们发现(图2)，PM暴露导致小鼠肺出现氧化还原失衡及铁蓄积。并且GPX4和COX2也在接受PM刺激后呈现明显改变，NCOA4和FTH1表达在PM刺激后也明显上调。而我们发现NaHS预处理能显著抑制PM介导的损伤性改变，并且我们发现明显增加小鼠肺组织内Nrf2和PPAR-γ的表达。有趣的是，Nrf2敲除显著抑制了NaHS的保护作用，表现为氧化应激增加，铁含量积累，COX2和FTH1水平升高，GPX4和PPAR-γ的表达降低。这些数据表明，NaHS可能通过激活PPAR-γ，抑制铁自噬和铁死亡来预防PM介导的肺气肿和气道炎症，而这一过程可能被Nrf2信号调控。

Fig.2. NaHS modulates PM-induced emphysema and airway inflammation by inhibiting ferroptosis in WT and Nrf2−/−mice.

3、NaHS 降低了PM2.5介导的BEAS-2B细胞脂质过氧化和铁死亡

使用BEAS-2B细胞系建立PM2.5介导的细胞模型。结果发现(图3)，PM2.5暴露引起的细胞活力下降，炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α的水平显著升高，LIP ROS、总ROS、MDA、NADP+/NADPH和COX2等氧化标志物的水平急剧增加，抗氧化蛋白GSH、GSH-px和GPX4的表达降低，以及Fe²⁺的积累。而NaHS预处理明显降低PM2.5介导的改变，内源性H2S产生酶CSE的抑制剂PAG加剧PM2.5介导的损伤。另外，我们发现PM2.5刺激导致线粒体发生了特征性的铁死亡变化，包括线粒体膜密度增加，嵴减少或消失。综上所述，NaHS可减轻PM2.5诱导的BEAS-2B细胞脂质过氧化和铁死亡。

Fig.3. NaHS mitigated PM2.5-mediated ferroptosis and celluar dysfunction, while PAG enhanced that in BEAS-2B cells. 

4、NaHS以铁自噬依赖的方式减弱了PM2.5介导的铁死亡损伤

细胞内活性铁增加是铁死亡的一个特征标志，而铁自噬能通过降解铁蛋白调节细胞内铁平衡。结果显示(图.4)，PM2.5处理激活细胞内LC3B、NCOA4和FTH1的表达。此外，PM2.5导致细胞内自噬流显著增加。而这些改变在NaHS预处理下显著增强，而在PAG预处理后减弱。这些结果表明，NaHS可能依赖于铁自噬作用而发挥抗铁死亡效应。接下来，我们使用特异性自噬抑制剂CQ进一步证实了自噬抑制可以减轻PM介导的铁致损伤。此外，利用铁螯合剂DFO进一步验证了PM2.5诱导的铁死亡损伤受铁含量的影响。总之，在BEAS-2B细胞中，PM2.5介导的铁死亡损伤是通过铁自噬通路来操纵的。

Fig.4. NaHS attenuated PM2.5-induced ferroptosis in an ferritinophagy-dependent manner in BEAS-2B cells.

5、NaHS以PPAR-γ依赖的方式减弱了PM2.5介导的铁死亡损伤

我们通过RNAseq技术比较不同组间信号通路表达的差异，经KEGG富集分析发现，PPAR信号通路在NaHS预处理组明显增加(图.5)。首先，PM2.5可以显著降低细胞中PPAR的表达，而NaHS可以显著逆转这一变化。其次，我们使用了PPAR-γ特异性抑制剂GW9662来验证PPAR-γ在PM2.5介导的铁死亡中的调控作用。在GW9662预处理后可见PM2.5介导的损伤作用明显加重，此外，GW9662共预处理显著抑制了NaHS的抗损伤作用。因此，NaHS的发挥抗铁死亡作用与调控PPAR-γ信号有关。

Fig.5. The anti-ferroptotic effect of NaHS is related to the regulation of PPAR-γ.

6、NaHS以Nrf2依赖的方式调控PM2.5介导的铁死亡损伤

人和小鼠肺组织结果显示各组Nrf2存在特异性改变，接下来我们在BEAS-2B细胞中继续检测探究Nrf2的变化。结果显示(图6)，PM2.5显著降低了Nrf2蛋白在细胞核和细胞质中的表达水平，而这些改变在NaHS预处理后得到了明显的恢复，PAG的共处理则加剧了PM2.5介导的这种不平衡。而使用Nrf2 siRNA处理细胞后给予PM2.5，可见损伤较正常细胞加重，且NaHS的调控作用明显被削弱。接下来，使用V5-Nrf2过表达质粒处理BEAS-2B细胞后可见，PM2.5的损伤作用明显低于empty-vector组。同时，V5-Nrf2过表达显著增强了NaHS预处理对IL-6、TNF-α、LIPROS、Fe²⁺、LC3B和NCOA4的调控作用(图7)。综上所述，H2S通过调控Nrf2的表达，发挥抗PM2.5介导的铁死亡。

Fig.6. The anti-ferroptotic effect of NaHS is related to the activation of Nrf2. 

Fig.7. Nrf2 overexpression enhances the anti-ferroptotic effect of NaHS.

研究结论及意义

本研究通过慢阻肺样本检测到患者肺组织中存在铁死亡现象，以此推测铁死亡可能在慢阻肺的发生发展中占据重要地位，而后通过建立PM诱导的WT和Nrf2基因敲除小鼠模型以及PM2.5介导的气道上皮细胞模型，旨在探究H2S在PM2.5诱导的肺气肿及气道炎症中的作用。我们发现外源性H2S能显著抑制PM介导的肺气肿、气道炎症，及PM2.5诱导的细胞损伤及炎症。H2S发挥保护作用的根本原因是阻断了PM2.5介导的铁死亡，恢复了氧化还原平衡，而H2S发挥抗铁死亡作用的过程受Nrf2信号、PPAR-γ信号及NCOA4介导的铁自噬通路调节。本研究结果表明H2S可能是抑制慢阻肺进展过程中的潜在有效药物，为H2S的进入临床应用提供了极具价值的参考资料。

全文检索信息：Wang Y, Liao S, Pan Z, et al. Hydrogen sulfide alleviates particulate matter-induced emphysema and airway inflammation by suppressing ferroptosis [published online ahead of print, 2022 Apr 28]. Free Radic Biol Med. 2022;S0891-5849(22)00160-5. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2022.04.014

作者介绍

陈亚红

主任医师、教授、博士生导师，博士后合作导师；北京大学第三医院呼吸与危重症医学科副主任，科研伦理综合办公室主任；专业特长：呼吸系统常见病及疑难危重症疾病；研究方向：气道慢性炎症疾病；中华医学会呼吸病学分会肺功能学组副组长；中国康复医学会呼吸康复专业委员会第二届委员会常务委员；中华医学会呼吸病学分会慢阻肺学组委员；中国医师协会呼吸病分会慢阻肺工作委员会委员；中国基层呼吸疾病联盟副主席；中华结核和呼吸杂志、中华医学杂志英文版等编委；承担多项国家级和省部级科研基金，获得北京市科技新星计划支持和教育部新世纪优秀人才支持计划。研究结果获得北京市科技进步三等奖和中华医学科技奖三等奖。

王莹

北京大学第三医院2019级博士研究生。

本文完

责编：Jerry