目前呼吸系统感染性疾病的病原微生物检出率仍然不能满足临床的需求。痰培养加涂片的阳性率50%左右，血培养的阳性率10-15%。上呼吸道感染，慢阻肺急性加重等的病原学确诊率更低。这些未能临床确诊的病例，以及在危重病患者由于强调早期应用广谱抗生素，使得抗生素的使用更加普遍，导致耐药菌的检出率普遍攀升，耐药菌感染治疗疗效较差，死亡率升高。常规微生物实验室确诊临床诊断比例低的原因是由于传统检测方法的局限性，在取标本之前应用了抗生素等。因此， 发展不依赖于传统培养的微生物分子诊断技术将有助于感染性疾病的诊治，提高诊断率，改善治疗的预后。

常见病原微生物

微生物病原学诊断的二代测序技术

根据病原微生物的核酸（DNA，RNA），细胞壁成分等可以诊断病原微生物。分子诊断的方法包括用引物放大核酸分子，再进行测序（NGS）。基于16sRNA的检测技术是根据16sRNA在不同菌种之间存在共性保守序列，同时存在可变序列用于菌种之间的鉴别，采用定量荧光PCR技术可以很好地扩增样本中的核酸，用于微生物种属的鉴定。缺点是不能区分死亡与存活的微生物。另外，由于技术本身的限制，仍然存在错配导致特异性有一定的变异。

PCR，RT-PCR，Term-PCR等改良技术陆续用于微生物的鉴定，在流感病毒检测中发挥了重要作用。目前可以做到2小时内出报告。二代测序技术则直接通过基因序列分析（核酸提取后建库），测序后与样本库中的病原微生物进行比对，从而判断微生物的种类。目前在咽拭子，肺泡灌洗，血液，胸水，痰液等标本中都得到了应用。该技术目前最快24小时内出报告，但成本相对较高。为提高检测的灵敏度，把引物粘附在纳米颗粒上，增加反应的面积，或接种于微流控微孔中，以及事先在平板上铺设特异性较强的引物等，这些改良方法极大提高了检测的高通量，敏感性和特异性等问题。

微生物检测需要注意什么

微生物检测方法学的灵敏度与特异性，跟诊断感染的敏感性和特异性是两个概念。从收集标本到诊断取材部位的感染状态需要进行严格的质量控制，防止标本污染，有效提取核酸（细胞破壁），以及确定诊断感染指标的理想截断值是微生物分子诊断的核心。大多数情况下，局部正常菌群的存在干扰了对结果的判断，因此，除了考虑去除菌群的背景，增加耐药基因检测，以及病原体毒力因素的检测有助于判断病原微生物是定植还是感染。

病原微生物诊断的未来

未来病原微生物的诊断是传统方法学继续改良，分子诊断和新的诊断方法有效补充，尤其是常规检测阴性的标本。根据病变部位的感染金标准来界定分子诊断的阈值，完善标本采样程序，避免污染并提高核酸提取效率，简化并加快检出速度，降低检测的成本，并开发适合不同标本和疾病检测的panel, 使感染的诊断更加个体化，以及检测病原微生物的毒力因子，耐药基因等是发展趋势。另外，分子诊断结合高通量检测病原微生物将有助于微生态研究的进一步开展，在菌群研究和致病机制探索，调控菌群治疗炎症和免疫性疾病上会有新的拓展。

作者介绍

宋元林

复旦大学附属中山医院呼吸与危重医学科副主任, 博士生导师；

中华医学会呼吸分会常委；中国康复学会呼吸康复专委会副主任委员；上海市呼吸病研究所副所长。

李华茵

复旦大学附属中山医院呼吸与危重医学科主任医师,医学博士，硕士生导师； 呼吸科肺部感染亚专科主任、临床微生物实验室主任；中华医学会呼吸分会感染学组委员。 

蒋进军

复旦大学附属中山医院呼吸与危重医学科RICU主任；中华医学会呼吸分会危重学组委员；中国医师协会呼吸分会危重症医学工作委员会常委。

陈淑靖

复旦大学附属中山医院呼吸与危重医学科主治医师。