Bassetti等发文预测，至2050年，抗生素耐药每年将造成世界上约1000万人死亡，高于恶性肿瘤致死人数[1]，而下呼吸道感染的耐药性对抗生素耐药性的影响最大[2]。我国是抗生素使用大国，据统计仅2013年我国一年的抗生素使用量高达16.2万吨，约占世界用量的一半，其中约48%为人用[3]。大量抗生素使用的原因之一在于感染性疾病病原学诊断困难，62%的社区获得性肺炎难以获得病原学依据[4]，只能经验性使用抗生素治疗，这造成了一定程度上的抗生素滥用。近年来，学界一直在探讨如何精准获得呼吸感染性疾病的病原学依据，并基于病原学依据规范使用抗生素，实现抗生素滥用及抗生素耐药的双降低，最终迈进呼吸感染性疾病的精准诊疗时代[5]。目前宏基因组高通量测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技术已经广泛应用于感染性疾病的病原学临床诊断[6-7]，我国也发表了多篇专家共识指导mNGS技术在临床上的规范应用[8-14]，呼吸感染领域甚至在2018年，就已经将mNGS技术写进了相关指南以指导呼吸感染临床实践[15]，随着近年来mNGS在呼吸感染领域中更加广泛的应用，mNGS技术是否能够引领呼吸感染性疾病迈进精准医学时代？呼吸领域专业医生观点不一，本文就此谈一谈我们的看法。

mNGS技术是通过对临床样本的所有DNA或RNA进行鸟枪法测序，可以无偏倚地同时检测多种病原微生物（包括病毒、细菌、真菌和寄生虫）。二代和三代测序平台均可用于该项技术。按从样本中提取的核酸类型不同可以分为宏基因组测序和宏转录组测序。按照测序模式可以分为单端测序和双端测序[12]。随着技术的逐步推广，目前已逐渐实现临床样本不出「医院」或者不出「本地区」的本地化检测模式。

一、mNGS技术在呼吸感染性疾病各类病原体临床诊断中应用实践

1、mNGS在呼吸系统细菌感染中的临床实践

呼吸系统细菌感染的主要病原体主要包括需氧菌，兼性厌氧菌及厌氧菌，此外还包括非典型病原体及结核分支杆菌及非结核分支杆菌等特殊类型[16]。对于肺部感染患者，mNGS的病原检测阳性检出率显著优于常规病原菌诊断方法（115/140，82.14%比50/140，35.71%，P<0.05)[17]。最近我国发起的一项全国多中心前瞻性临床研究也进一步证实，mNGS对于重症社区获得性肺炎病原检出率为90.3%，而传统微生物检测技术的病原检出率仅有39.5%[18]。此外，mNGS对于肺部厌氧菌相关感染也有很好的诊断效率[19]，显著弥补了传统微生物检测对于肺部厌氧菌感染诊疗的不足。研究显示，肺部厌氧菌感染的标本中mNGS病原检出率为71.43%（10/14），远高于培养7.14%（1/14）（P<0.01）[20]。此外，mNGS检测还进一步明确了以前认识非常不足的肺部感染病原微生物，比如微小微单胞菌肺部感染[21]。对于非典型病原体感染，例如鹦鹉热衣原体，近两年，这种以前少见的重症肺炎致病病原体因mNGS技术的广泛应用，发现的越来越多，临床医生对此类病原体的认识也越来越深入[22-24]。一项回顾性研究证实mNGS诊断肺结核的敏感性为59%（59/100），显著高于涂片法（15%，15/100）和培养法（26%，26/100），差异均有统计学意义（均P<0.001），但与Xpert法（52%，52/100）比较差异无统计学意义（P=0.090）[25]；国内多项相关研究也得出了类似的相似结论，但是mNGS在明确结核合并其他感染时具有独特优势[26-27]。需要明确的是，在排除污染情况下，即使测到一条结核序列也要考虑其是致病菌可能性[11]。目前阶段，对于肺结核诊断，可以通过mNGS联合Xpert及传统结核诊断方法提高诊断的敏感性。而需要强调的是测序深度对低丰度物种鉴定、对测序数据可信度均有影响[28]，且测序深度影响mNGS的敏感性[10, 12, 29]，或许提高测序深度能进一步调高mNGS对于肺结核的诊断敏感性，这需要进一步的研究证实。

2、mNGS在呼吸系统真菌感染中的临床实践

真菌是呼吸系统重要的感染病原之一[15-16]。最近的临床实践研究证实mNGS对于隐球菌、肺孢子菌、曲霉以及根霉等都有很好的诊断效率，可以提高重症肺炎真菌病原学诊断的敏感性，可作为传统真菌微生检测手段的有效补充方法[30-32]，同时能够明确少见真菌感染，如波氏假阿利什霉[33]。尤其是对于免疫力低下患者常继发的肺孢子菌肺炎，mNGS不但敏感性高、特异性好，还可以检出合并的其他病毒或细菌混合感染，并且发现肺泡灌洗液和血液样本中mNGS检测肺孢子菌结果高度一致[18, 31]。需要注意的是对于在核酸提取过程中破壁困难的真菌，主要包括曲霉、毛霉、隐球菌属与双相真菌等，即使在检测报告中序列数较低，也要考虑其为致病微生物[12]。

3、mNGS在呼吸系统病毒感染中的临床实践

病毒作为呼吸系统感染的主要病原微生物之一[15-16]，近年来越发受到临床重视，尤其是近年来新型冠状病毒肺炎疫情的出现[34-35]。由于呼吸道样本中病毒的核酸提取难度相对较简单[12]，因此只要有合适的引物，理论上讲mNGS对于呼吸系统病毒感染的诊断敏感性不优于相应的病毒PCR检测[36]，而且如果是RNA病毒引起的相关感染，必须行mNGS RNA测序才能明确诊断，mNGS DNA检测是不能识别RNA病毒相关感染的[12, 32]。mNGS对于呼吸系统病毒感染的优势主要在于新发未知病毒感染（如SARS-CoV-2[34]）及少见病毒感染诊断，例如最近报道的运用mNGS技术快速明确单纯疱疹病毒性肺炎案例[37]，另外一项研究也证实了mNGS技术在重症腺病毒７型肺炎快速精准诊断中的重要作用[38]。

4、mNGS在呼吸系统混合病原体感染中的临床实践

最近中国疾病预防控制中心基于传统微生物检测技术的一项来自我国106个城市、277家哨点医院和92个参考实验室，历时11年的呼吸道传染病监测数据明确了我国呼吸道感染的主要病原谱特征，其中混合感染不容忽视[39]。最近一项基于mNGS技术的研究也提示在纳入的329例重症社区获得性肺炎患者中使用mNGS技术联合常规微生物检测方法进行病原体检测，117例患者（35.9%）仅有1种潜在病原体，60例患者（18.2%）有2种潜在病原体，73例患者（22.2%）有3种潜在病原体，54例患者（16.41%）至少有4种潜在病原体[18]。因此，临床医生应进一步提高对呼吸系统混合病原体感染的诊疗认识。一项纳入159例社区获得性肺炎患者的队列研究提示mNGS相对传统检测能够明确更多的混合病原体感染[40]。尤其是对免疫抑制患者相关的呼吸系统感染，存在更多的混合病原体感染，mNGS技术体现出了其检测范围广的独特优势[18, 21, 41]。因此，在mNGS技术时代，如何根据mNGS检测报告，结合传统微生物检测结果及患者临床信息准确识别并精准确定真正的「责任」病原菌是实现呼吸道混合病原菌感染的关键[7, 11-12]。

二、mNGS技术在呼吸感染性疾病诊疗实践中的关键点

1、缺乏统一规范的mNGS技术及报告解读标准

mNGS技术目前已经是一项成熟的技术，国内也有数十家从事相关技术临床应用的公司及机构，不同机构mNGS技术具体实施细节也不尽相同，临床医生对于报告的临床解读也缺乏统一规范标准，存在基于个人临床微生物经验性认知的「经验性」解读状况。为进一步规范mNGS技术在临床上的规范应用，我国相关部门开展了全国多中心的mNGS试剂质量评价联合研究与mNGS室间质量评价研究[42-43]，结果不容乐观。现阶段制约mNGS临床规范应用的主要瓶颈，逐渐由技术本身的局限和挑战转变为相关试剂耗材及生物信息学分析的质量控制与评价方法以及质量标准等的缺失[44]。此外，不同室间对标准品检测结果存在差异，且假阳性和假阴性问题突出[42]。对于报告结果解读，尤其是呼吸道感染相关检测报告，缺乏临床医生及微生物相关专家的深度参与。相关研究也进一步提出并建议开展基于「本医院」的本地化mNGS应用模式，以规避并解决影响mNGS技术临床规范应用的相关因素[42, 45]。

2、mNGS技术在感染性疾病临床实践中的关键点

1）抗生素提前应用对mNGS检测结果的影响比传统微生物检测小

相关研究显示在96例mNGS检测前2周接受抗生素治疗的患者中，血标本的mNGS病原检出率47.9%；血培养则只有19.6%[46]。主要原因是因为mNGS技术检测的是微生物的核酸物质，因此只要有微生物的核酸物质存在，理论上讲就能够被检测出来。

2）对于免疫力低下患者，糖皮质激素使用量不影响mNGS病原检出率

关于糖皮质激素等对mNGS病原检出率的影响，一项研究纳入了108例接受糖皮质激素治疗的免疫抑制疑似感染的患者，结果提示，累计使用糖皮质激素量大的免疫抑制患者中，mNGS病原检出率不受糖皮质激素药量影响[47]。

3）mNGS技术指导临床更改抗生素治疗方案并改善呼吸系统感染患者预后

既往一项回顾研究发现，依据mNGS检测结果，感染性疾病患者初始经验性抗生素治疗未覆盖可能致病菌的概率高达58.6%[48]。而在近年来的呼吸感染诊疗临床实践中，多数临床医生已经开始根据mNGS检测报告调整初始的经验性抗生素使用[18]，且根据mNGS检测结果进行相关临床用药调整，能够显著提高呼吸系统感染患者的预后[49-51]。

4）血液mNGS检测可替代难以获得肺泡灌洗液样本的重症呼吸感染

一项纳入20例重症肺炎患者的研究显示，同时送检血液和肺泡灌洗液行mNGS检测，肺泡灌洗液中的病原菌与血液样本中的病原菌高度一致[52]。但是相关研究病例数少，还需要大样本量的队列研究进一步验证相关结论。

5）实验室环境、耗材、实验操作及参考数据库可能影响mNGS检测结果

已有研究使用脑脊液样本探讨mNGS技术20 M数据量对不同的病原微生物检出下限：巨细胞病毒（14拷贝数/mL），肺炎克雷伯菌（8 CFU/mL），人类免疫缺陷病毒（313拷贝数/mL），无乳链球菌（10 CFU/mL），黑曲霉菌（220 CFU/mL），新型隐球菌（0.2 CFU/mL），弓形虫（81个/mL）[44, 53]。可见，mNGS对于样本中的微生物检测灵敏度之高，但这也带来了另一个问题—「污染」，主要包括实验耗材、环境（包括空气环境）、实验技术人员皮肤、实验操作、甚至同批次强阳性样本中微生物导致的污染[54]。因此，当mNGS检测结果阳性，而和临床传统检测结果及临床疑似感染病原菌不符，尤其是肺泡灌洗液样本，除了要考虑上呼吸道微生物污染，也要考虑上述实验环境及实验操作相关微生物污染的可能性。此外，各个机构所自有的mNGS微生物注释参考数据库不同，主要分为全基因组核酸序列数据库、编码蛋白的核酸序列数据库和含有物种特征基因序列数据库，基于全基因组核酸序列数据库可能对比到的测序序列数最高，其他两类数据库对比到的测序序列数相对较少，但是特异性却更高。因此，单纯基于mNGS测序序列数设置阈值，再判断所发现微生物是否具有致病性是不合时宜的[55]。综上，对于mNGS技术临床规范应用，需要临床医生和检测机构实验操作人员深入的实时沟通，这也凸显了以「医院」为主体，mNGS本地化检测的优势[42]。

6）测序数据量、破壁及去宿主DNA实验操作显著影响mNGS检测结果

测序深度对低丰度物种鉴定和测序数据可信度均有影响[28]，且测序深度影响mNGS的敏感性[10, 12, 29]，为避免假阴性，一般20 M数据量是较好的测序深度选择[43]，而如果疑似致病菌量少，可选择提高测序深度以提高阳性率。

细菌、真菌、病毒和寄生虫的特性不同，增加破壁（例如使用玻璃珠研磨样本）有利于提高难破壁细菌和真菌的核酸提取效率，但是可能损失病毒核酸[56]。因此，临床医生需要根据临床疑似致病菌结合是否行破壁操作，综合判断mNGS报告的临床符合率[11-12]。

目前去除宿主DNA的方法主要包括去污剂处理（皂苷）、低渗溶液破坏宿主细胞及抗甲基化DNA磁珠等[11]，目前所有的去宿主DNA操作均可能导致样本中微生物数的绝对损失，尤其是对样本中病毒、革兰阴性菌及可能致病的少量微生物影响较大，导致假阴性结果[43]。因此，目前技术条件下，为确保mNGS检测结果阳性率，提高测序数据量相对来说优于去宿主DNA操作[11-12, 14]。

7）依据呼吸道样本mNGS检测结果中的抗生素耐药基因指导临床抗生素使用任重道远

相关专家共识目前不建议使用mNGS技术检测呼吸道样本中微生物的耐药性[12]。目前mNGS检测细菌、真菌耐药性基因存在较高的假阳性和假阴性，基因型和表型可能不一致，尤其对于呼吸道样本，微生物种类多样，而且目前大部分的mNGS都是以二代测序的短片度测序为主，组装后明确的耐药基因不能确定来自具体的哪个菌种，耐药基因的解释存在较大难度[12, 43, 45]。

8）mNGS技术的规范化应用需要检测人员和临床医生形成讨论集体

mNGS技术是不同于传统微生物检测技术，涉及适宜患者选择、规范样本采集、复杂实验室操作、生物信息学分析及报告规范解读，需要检测人员与临床医生形成实时讨论集体，实现mNGS技术的规范化临床应用[45, 57]。

三、mNGS三代测序平台应用是实现呼吸系统感染性疾病快速诊疗的主要未来方向

mNGS技术三代测序平台纳米孔测序近年来飞速发展，牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies，ONT）测序的准确性已经从最早的64%增加至如今的95%，目前的测序长度也可以达到50 kb，随着已有的及新的微生物参考基因组序列完善，更高的测序准确性（>99%）、更长的测序长度，以及测序所需的DNA和RNA样品量进一步降低[58]，纳米孔测序技术将实现呼吸系统感染性疾病8小时以内的床旁快速诊断[59]。目前纳米孔测序技术在耐药基因的检测应用上还主要集中在单菌检测上[60-61]，未来随着技术的进步，对于呼吸道复杂微生物样本，基于长片段的纳米孔测序技术将来自不同细菌基因组的抗生素耐药基因彼此分开，以进行后续分析及临床应用。

mNGS技术目前已引领呼吸系统感染性疾病迈向精准医学时代，但是其临床应用还存在众多不足，迫切需要各个机构推动基于「本医院」的本地化mNGS技术临床应用模式，从而解决mNGS技术临床规范应用难题，真正让mNGS这个「明天的技术」解决今天呼吸系统感染的快速、精准、规范诊疗难题。

利益冲突：本文不涉及任何利益冲突。

参考文献略。

引用本文：周永召, 陆思芬, 刘丹, 范红, 王业, 李为民. 宏基因组高通量测序技术能够引领呼吸感染性疾病迈进精准医学时代吗？. 中国呼吸与危重监护杂志, 2022, 21(2): 137-141. doi: 10.7507/1671-6205.202202029

本文转载自公众号「中国呼吸与危重监护杂志」

原链接戳：宏基因组高通量测序技术能够引领呼吸感染性疾病迈进精准医学时代吗？

本文完

责编：Jerry