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摘要
外泌体是细胞多囊泡体与细胞膜融合后释放到细胞外基质的一类直径40~100 nm的膜性囊泡，携带丰富的蛋白、脂质及核酸等内容物。外泌体可由多种细胞分泌，参与免疫调节、细胞间通讯等生理过程，是细胞间信息交流的一种重要工具。研究发现外泌体可以参与机体生理和病理机制、诊断或判断疾病预后。
外泌体（exosome）是细胞质膜内陷形成的细胞多囊泡体与细胞膜融合后释放到细胞外基质的膜性囊泡，其直径40~100 nm[1]，首次发现于1985年，Pan等[2]发现网织红细胞在成熟过程中可分泌直径约50 nm的小囊泡，这种小囊泡可以将转铁蛋白通过胞吐形式分泌到细胞外。外泌体在体内来源和分布广泛，可将携带的蛋白、脂质和核酸等物质传递到相邻及远处细胞参与机体的生理病理过程，是细胞间信息交流的一种重要工具[3,4]。
一、外泌体的功能研究
外泌体是在细胞核小体内形成并释放到细胞微环境的多泡体，内含丰富的酶、microRNA、转录因子、信号转导因子等物质，其形成和分泌受Rab蛋白、细胞骨架蛋白、细胞内钙离子水平等多种因素影响[5]。外泌体由细胞膜经过两次内陷形成，故不同细胞来源的外泌体均含有相同的蛋白标志物，如CD9、CD63、CD81、Alix、TSG101等，但其内容物和数量与亲本细胞息息相关，外泌体存在于人体血液、唾液及羊水等体液中，在体内发挥诸多功能[6]。
外泌体与受体细胞表面结合后，可直接入胞或激活细胞表面受体发挥生物学功能。外泌体可参与机体的抗原呈递及免疫调节，巨噬细胞释放含MHCⅡ类和共刺激分子的外泌体，可与DC来源的外泌体共同参与抗原呈递；活化的巨噬细胞释放含肿瘤坏死因子、炎性细胞因子等内容物的外泌体，增强NK细胞活性；中性粒细胞根据刺激源不同产生不同类型的外泌体从而发挥活化或抑制作用；T细胞释放的外泌体靶向多种细胞从而发挥多种免疫调节作用[7]。
外泌体可参与细胞间信息传递，研究发现在小鼠的原代皮层神经元培养基中提取的外泌体可被星形胶质细胞内化，从而使大脑摄取谷氨酸的重要介质兴奋性氨基酸转运子2 (EAAT2）上调；亲脂性染料标记少突胶质细胞，将其同神经元细胞共培养，在神经元细胞中可见亲脂性染料荧光颗粒，验证了外泌体在神经元和神经胶质细胞间发挥信息传递功能[8]。Pegtel等[9]用EB病毒感染B细胞后，发现B细胞释放的含EBV-miRNAs外泌体可被单核细胞来源树突状细胞（MoDC）摄取，而在临床无症状的患者外周血中发现EBV-miRNAs同时存在于感染的B细胞中和非B细胞中，证实了外泌体在细胞间重要的通讯作用。
外泌体可参与机体衰老过程，Zhang等[10]发现下丘脑神经干细胞分泌的外泌体与衰老相关，幼年小鼠与中老年小鼠脑脊液外泌体miRNA存在显著差异，通过miRNA芯片分析发现在中老年小鼠脑脊液中超过20种miRNA明显减少，而将新生鼠下丘脑干细胞外泌体植入胸腺激酶/更昔洛韦诱导下丘脑神经干细胞消融的中老年小鼠体内可减缓衰老速度，可见外泌体在机体衰老中发挥一定作用。
此外，外泌体可参与机体修复和再生，Nojima等[11]通过体外实验发现鼠原代肝细胞分泌的外泌体可以促进肝细胞的增殖，并通过缺血/再灌注损伤和部分肝切除术模型证实原代肝细胞分泌的外泌体可促进细胞增殖和肝脏再生。
二、外泌体在肺部疾病中的研究
1支气管哮喘（简称哮喘）
哮喘是多种细胞（如嗜酸粒细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等）和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，其中白三烯在哮喘的发病中起到重要作用。文献报道气道上皮细胞、肺泡巨噬细胞、血管内皮细胞等多种细胞分泌的外泌体可参与哮喘的发病过程，Esser等[12] 发现巨噬细胞和树突状细胞分泌的外泌体可通过白三烯的生物合成而参与哮喘的炎症反应。Torregrosa Paredes等[13] 在人的肺泡灌洗液中分离出外泌体，发现哮喘患者的外泌体含量高于健康人，而将哮喘患者肺泡灌洗液提取的外泌体作用于支气管上皮细胞可增加白三烯和炎症因子的释放，提出外泌体可能通过诱导肺内炎性因子和白三烯的生成而引起气道炎症。研究人员体内实验发现哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中的外泌体含量高于对照组，体外实验发现IL-13处理的上皮细胞分泌的外泌体可导致单核细胞的增殖，而应用外泌体分泌抑制剂GW4869可减少哮喘模型小鼠单核细胞的增殖和炎症反应，从而证明外泌体在哮喘发病中发挥重要作用[14] 。除在肺泡上皮细胞、巨噬细胞发现外泌体外，有研究者发现中性粒细胞衍生的外泌体可以增加气道平滑肌细胞的增殖，在哮喘疾病进程及气道重塑中发挥重要角色[15] 。Haj-Salem等[16] 同样发现支气管成纤维细胞分泌的外泌体在哮喘发病中发挥重要作用，IL-6、IL-8、SCF等因子在重症哮喘患者成纤维细胞分泌的外泌体较健康对照组高表达，体外实验发现重症哮喘成纤维细胞来源外泌体可促进支气管上皮细胞的增殖，表明外泌体部分参与了哮喘的气道重塑。
有学者发现哮喘患者嗜酸粒细胞分泌的外泌体含量高于健康人，提供了新的思路：外泌体具有成为哮喘诊断生物标志物的可能[17] 。Levänen等[18] 从健康对照组和哮喘患者的肺泡灌洗液中分离出外泌体，分析发现哮喘患者和健康对照组外泌体miRNA的具有显著差异，包括与气道炎症、气道重塑相关的let-7家族和miRNA-200家族成员，提示外泌体中miRNA具有作为哮喘疾病诊断的潜力。此外，提取卵清蛋白喂养的小鼠血清的外泌体，经腹腔注射给受体小鼠后，受体小鼠肺泡灌洗液中嗜酸粒细胞和血清IgE减少，纵隔和腹腔淋巴结T细胞表现出显著的高频率活化且具有调节表型[19] 。Prado等[20] 构建特异性过敏原耐受小鼠模型，提取免疫耐受小鼠和对照组肺泡灌洗液中外泌体，将免疫耐受外泌体和天然外泌体经鼻回输给过敏性小鼠，发现免疫耐受外泌体可抑制IgE反应、Th2细胞因子的产生和气道炎症的发展，并在体内维持特异性的长期保护作用，提供外泌体作为疫苗治疗过敏性疾病的新方向。外泌体具有调节机体免疫的功能，在哮喘发病中具有重要作用，越来越多的研究探索外泌体可作为诊断、预防或治疗哮喘的一种潜在方法。
2慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）
慢阻肺是通常由有害颗粒或气体暴露引起的气道和（或）肺泡异常的疾病。随着外泌体功能的研究，研究者发现外泌体在肺部疾病发挥着同样重要的作用，外泌体作为细胞间通讯的一种方式，参与了气管微环境的调节[21] 。Fujita等[22] 发现烟雾提取物可导致人支气管上皮细胞分泌的外泌体中miR-210表达的相对上调，且miR-210通过抑制自噬相关基因7（ATG7）使肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，从而参与COPD气道重塑。Xu等[23] 将烟草烟雾处理的人支气管上皮细胞与人成纤维细胞MRC-5共培养，发现烟草烟雾处理的人支气管上皮细胞分泌的外泌体中miR-21可通过pVHL / HIF-1α信号通路促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，再次验证外泌体在COPD发病中的重要作用。Tan等[24] 通过对比慢阻肺急性加重期患者和非吸烟健康者外周循环外泌体，发现慢阻肺急性加重期患者外泌体中CRP、sTNFR1、IL-6水平高于对照组，且外泌体中CRP、sTNFR1、IL-6与血浆中CRP、sTNFR1、IL-6水平相关，提出外泌体可能参与了慢阻肺急性加重期的炎症反应过程。
近期研究结果显示，多形核中性白细胞分泌的外泌体过度活化引起慢阻肺患者出现肺气肿，提出对多形核中性白细胞外泌体进行定量研究，可能有益于慢阻肺患者疾病活动监测、治疗疗效和早期疾病检测[25] 。研究者通过比较非吸烟健康者、吸烟健康者及吸烟出现早期肺损伤者血浆内皮微囊泡水平，发现吸烟出现早期肺损伤者血浆内皮微囊泡的水平明显升高，提出血浆内皮微囊泡的水平可能成为早期肺气肿的检测指标，以早期预防并防止不可逆的肺损伤[26] 。Takahashi等[27] 比较慢阻肺稳定期患者、慢阻肺加重期患者及健康非慢阻肺患者循环内皮微囊泡水平，发现内皮微囊泡水平与病情进展呈正相关，而检测体内循环内皮微囊泡的水平变化可作为疾病评估和药效的指标。2014年他们再次报道证实循环内皮微囊泡水平是检测慢阻肺病情变化的指标，且其在体内水平与FEV1呈负相关，通过检测体内循环内皮微囊泡的变化对于无法行肺功能检查的慢阻肺患者，提供一种新的病情评估方法[28] 。
3肺部肿瘤
肺癌是最常见的恶性肿瘤，目前对于肺癌的诊断和治疗已取得一定成就，但其发病机制仍未明确。肿瘤微环境在癌症的发生发展过程发挥重要作用，而肿瘤细胞分泌的外泌体作为信息传递的方式同样发挥重要作用。Melo等[29]研究发现肿瘤细胞分泌的外泌体具有促癌作用，比如，低氧条件下癌细胞可以通过低氧诱导因子HIF-1α增加外泌体的分泌，而低氧环境下的癌细胞分泌的外泌体含有更多的与血管生成与肿瘤转移相关的蛋白物质。Fabbri等[30]研究发现肺癌细胞株A549外泌体中的miR-21和miR-29a可作为配体与toll样受体（TLR）家族的受体（小鼠TLR7和人类TLR8）结合，从而触发TLR介导的促进转移炎症反应，最终可能导致肿瘤生长和转移。
外泌体为膜性结构，可保护其腔内内容物避免受到细胞外蛋白酶的降解，在储存条件下具有高度稳定性，且与体液相比，其样本复杂性较低，在临床中用于生物标志物检测具有巨大的潜力[31]。Cazzoli等[32]分析50例肺腺癌、30例肺肉芽肿和25名健康吸烟者血浆外泌体miRNA，发现外泌体中的miR-378a、miR-379、miR-139-5p和miR-200b-5p可将研究对象分为结节组（肺腺癌+肉芽肿）和非结节组（健康的吸烟者)，其敏感度为97.5%，特异度为72.0%，曲线下面积为90.8%；而miR-151a-5p、miR-30a-3p、miR-200b-5p、miR-629、miR-100和miR-154-3p可区分结节组中的肺腺癌和肉芽肿，其诊断试验的敏感度为96.0%，特异度为60.0%，曲线下面积为76.0%。此外，研究人员发现吉非替尼耐药非小细胞肺癌患者血浆外泌体PLAUR mRNA高于吉非替尼敏感的非小细胞肺癌患者，PLAUR可通过EGFR/p-AKT/survivin信号通路诱导吉非替尼耐药，PLAUR有可能成为吉非替尼耐药的非小细胞肺癌患者的新靶点[33]。目前外泌体作为肿瘤治疗方法已开展临床前期研究，树突状细胞来源外泌体（Dex）的膜含有多种免疫反应蛋白，可产生肿瘤相关抗原并激活T细胞，利用Dex在肺癌中已开展Ⅰ期和Ⅱ期临床试验。Besse等[34]选取无肿瘤进展且不能手术的非小细胞肺癌（NSCLC）患者22例，诱导化疗后应用负载MHCⅠ和MHCⅡ类肿瘤限制抗原的INF-γ-Dex作为维持免疫治疗，主要终点是观察化疗结束后4个月至少50%的无进展生存（PFS）患者；22例中位进展时间为2.2个月，中位总生存期为15个月，7例患者（32%）稳定期超过4个月，部分NKp30表达缺陷的NSCLC患者中，NKp30依赖性NK细胞功能增强，证实了Dex具有增强晚期NSCLC患者NK细胞免疫功能的作用。
4弥漫性实质性肺疾病
弥漫性实质性肺疾病是以肺泡炎症和间质纤维化为基本病变的肺部疾病。目前关于弥漫性实质性肺疾病发病机制仍不明确，研究发现外泌体在弥漫性实质性肺疾病中发挥一定作用，研究者从肺纤维化模型小鼠肺泡灌洗液和人肺泡灌洗液（IPF患者、非IPF的ILD患者、非ILD患者和健康志愿者）中提取外泌体发现与对照组相比小鼠及肺纤维化患者的肺泡灌洗液外泌体含量增加，而外泌体介导WNT-5A信号促进成纤维细胞的增殖从而促进IPF疾病的发病[35]。
Makiguchi等[36]通过使用microRNA PCR阵列检测博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型，筛选出外泌体miR-21-5p，发现其在IPF患者血清表达明显高于健康对照组，通过生存分析，发现血清外泌体miR-21-5p高的IPF患者在30个月内预后明显降低，提示血清外泌体miR-21-5p可能成为IPF预后的一种标志物。而Njock等[37]从IPF患者痰中提取出外泌体，通过miRNA定量PCR组学分析发现IPF患者和健康对照组痰外泌体miRNA存在统计学差异，并确定3个有意义的miRNA，其中miR-142-3p与肺一氧化碳/肺泡容积的扩散能力呈负性相关，从而为IPF疾病诊断和病情评估提供新的潜在生物标志物。干细胞具有组织修复功能，研究人员通过比较间充质干细胞和间充质干细胞释放的外泌体治疗模型肺纤维化，发现干细胞主要通过外泌体形式发挥组织修复功能，为肺组织修复治疗开辟了新途径[38]。研究发现人羊膜上皮细胞来源外泌体（hAEC Exo）携带的蛋白物富集了MAPK信号通路、凋亡和发育生物学通路，miRNA富集了PI3K-Akt、Ras、Hippo、TGF-β和局灶性黏附通路；hAEC Exo可以增强巨噬细胞吞噬作用，减少中性粒细胞髓过氧化物酶，直接抑制T细胞增殖；hAEC Exo经鼻治疗小鼠肺纤维化模型可减少肺部炎症和肺纤维化，具有抗纤维化、免疫调节和再生功能，为肺纤维化提供新的治疗方向[39]。
5急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征（ALI/ARDS）
ALI/ARDS是由肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤引起的弥漫性肺间质及肺泡水肿。Moon等[40]发现小鼠经高氧刺激后，其肺泡灌洗液和血清中肺上皮细胞来源的外泌体含量增加，这些外泌体通过ROCK1通路激活巨噬细胞参与急性肺损伤炎症反应，提示了外泌体在急性肺损伤中的发挥重要作用。Bastarache等[41]发现急性呼吸窘迫综合征患者与心源性肺水肿患者相比，其肺内水肿液中含有更多的上皮细胞来源的微囊泡，这些微囊泡富含具有促凝活性的组织因子；体外实验发现炎症因子混合物（TNF-α 、IL-1β、IFN-γ）刺激的肺泡上皮细胞可释放包含促凝因子微囊泡，这些微囊泡可促进肺泡内纤维蛋白沉积，揭示了上皮细胞来源微囊泡在ALI/ARDS发病中可能机制。
ALI/ARDS的局部和全身性炎症反应是由循环细胞如白细胞、血小板和内皮细胞之间的相互作用协调的，而细胞释放的微囊泡被证明可以评估炎症反应，研究者收集ARDS患者、自主呼吸患者和通气对照组的支气管肺泡灌洗液及血液中的微囊泡，发现肺泡灌洗液及血液中均含有白细胞微粒（LeuMP)、中性粒细胞微粒（NeuMP)、内皮细胞微微粒（EMP）和血小板微粒（PMP)，且LeuMP与急性呼吸窘迫综合征预后呈负相关，提示LeuMP具有成为ALI/ARDS预后生物标志物的可能[42]。干细胞具有减轻损伤和修复的功能，目前研究人员在探索干细胞在不同疾病中的治疗疗效，Wu等[43]对脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤模型移植血管内皮祖细胞来源外泌体，发现其通过把miR-126转移到靶内皮细胞后导致SPRED1下调，促进RAF/ERK信号通路，从而改善内皮细胞功能起到减轻肺损伤及促进肺修复的作用，为临床治疗提供新的方向。Zhou等[44]用人内皮祖细胞（EPC）来源外泌体以气管内给药方式治疗脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤小鼠模型，发现EPC来源外泌体可降低髓过氧化物酶（MPO）活性，减轻肺损伤评分、肺水肿及LPS诱导的急性肺损伤；同时发现外泌体中的MiR-126-3p和miR-126-5p增加紧密连接蛋白的表达及维持肺泡上皮屏障的完整性，证明了EPC外泌体可通过将miR-126传递到上皮细胞而减轻肺损伤的机制，同时为外泌体雾化治疗提供新思路。
6呼吸系统感染性疾病
呼吸系统感染由多种微生物包括细菌、病毒、支原体、真菌、寄生虫等引起。微生物感染宿主时可通过分泌外泌体引起机体炎症反应，Giri和Schorey[45]发现被结核分枝杆菌感染的巨噬细胞分泌的外泌体中含有分枝杆菌的脂质成分，这些含分枝杆菌的脂质成分的外泌体可以刺激幼稚巨噬细胞发生炎症反应、CD4+和CD8+脾T细胞活化、骨髓来源的树突状细胞的活化和成熟，参与机体免疫应答反应。研究发现HIV感染宿主时将含有nef蛋白和可溶性Tat蛋白以外泌体形式释放至机体，可溶性Tat蛋白在机体内发挥促进血管生成和内皮细胞重编程等生物学作用，nef蛋白促进被HIV感染的细胞释放外泌体，这些外泌体被CD4+T细胞摄入后可增加T细胞易感性从而促进病毒复制[46]。有学者将新生隐球菌分泌的囊泡与哺乳动物巨噬细胞共培养，发现这种囊泡可以促进巨噬细胞分泌细胞外肿瘤坏死因子（TNF-α)、白细胞介素-10 (IL-10)、转化生长因子（TGF-β）等因子及一氧化氮，但其机制仍不明确[47]。Lee等[48]用铜绿假单胞菌感染小鼠模拟细菌性肺部感染模型，并提取小鼠肺泡灌洗液中外泌体行RNA分析发现肺泡灌洗液中外泌体中miRNAs主要来源于肺泡Ⅰ型上皮细胞；肺泡Ⅰ型上皮细胞分泌的富含miRNAs的外泌体可主动进入肺泡巨噬细胞从而促进炎性小体激活、中性粒细胞募集和M1-巨噬细胞极化，在细菌性肺炎中发挥促进炎症作用。
目前足够敏感和特异的生物标志物仍然是临床感染性疾病面对的难题，研究人员对活动性肺结核患者和潜伏感染者血清外泌体采用多反应监测质谱（MRM-MS）方法靶向蛋白质组学分析，发现33种特异性蛋白和20个肽段，其中8个蛋白（抗原85B、抗原85C、Apa、BfrB、GlcB、HspX、KatG和Mpt64）的多肽有作为持续活跃和潜伏的结核分枝杆菌感染的生物标志物[49]。Lv等[50]对来自健康对照组（HC)、活动性结核病（ATB）和潜伏结核感染（LTBI）患者血清样本的外泌体进行了RNA测序分析，发现LTBI和ATB中存在众多不同上调和下调的差异表达基因（DEGs)，且在不同阶段的结核分枝杆菌感染中，外泌体包含不同的RNA；这为潜伏性和活动性结核病的诊断提供了潜在的生物标志物。Pei等[51]对社区获得性肺炎（CAP）、慢阻肺急性加重及健康对照组血浆外泌体表面蛋白进行分析，发现CD45和CD28可用来鉴别CAP和慢阻肺急性加重，提供了外泌体作为疾病诊断标志物的依据。Monsel等[52]用人间充质干细胞来源微囊泡（MSC-MV）治疗小鼠细菌性肺炎模型，发现MSC-MV可以减轻肺部炎症和提高小鼠存活率，体外证实MVs通过增强单核细胞吞噬作用、降低炎症细胞因子的分泌及增加损伤的肺泡2型上皮细胞内ATP水平发挥治疗作用，提示MSC-MV与MSC效果一样，可作为无细胞的干细胞治疗方法。
7其他肺部疾病
Bucciarelli等[53]发现静脉血栓栓塞患者血浆微囊泡水平高于健康对照组，且提示血浆微囊泡含量可能是静脉血栓栓塞的独立危险因素。而其他学者比较临床怀疑肺栓塞和健康对照血浆微囊泡活化因子，发现怀疑肺栓塞患者血浆微囊泡增高，但其活化因子无统计学差异[54]。关于外泌体与肺栓塞疾病的关系仍需进一步研究。
Bakouboula等[55]通过检测20例肺动脉高压患者与对照组血液循环微囊泡水平，发现肺动脉高压患者含有较高水平包含TF活性形式的微粒，提示用循环微囊泡评估肺动脉高压严重程度有望成为临床评估病情的工具。翻译控制的肿瘤蛋白（TCTP）是一种促增殖和抗凋亡的调节因子，研究发现其在遗传性肺动脉高压患者中高表达。Ferrer等[56]从具有BMPR2突变的肺动脉高压患者和健康对照组提取内皮细胞（BOEC），体外沉默BOECs中TCTP后发现BOECs形态和细胞骨架组织发生变化、细胞凋亡增加以及迁移能力下降，提示TCTP在肺动脉高压中发挥重要作用；体外共培养实验发现外泌体将TCTP从内皮细胞转移到肺动脉平滑肌细胞从而发挥促进细胞增殖和抗凋亡的作用；该研究提示检测外泌体中的TCTP可能是肺动脉高压诊断的潜在生物标志物，同时为肺动脉高压治疗提供新的方向。外泌体在血管生成、内皮再生发挥重要功能，Willis等[57]将新生小鼠暴露于高氧环境（HYRX；75% O2)，出生后第4天给予间充质干细胞（MSCs）来源的外泌体，生后第7天恢复常氧；暴露于HYRX的小鼠表现出明显的肺泡结构破坏、纤维化和肺血管重塑，MSCs来源外泌体可减轻纤维化和肺血管重塑，从而降低肺动脉高压；体外实验发现MSC来源外泌体可调节巨噬细胞表型，提示MSC来源外泌体可以改善高氧诱导的支气管发育不良。
三、小结
外泌体是机体微环境中的重要组分，参与呼吸系统疾病、肿瘤及其他疾病的发生与发展。与传统生物标志物相比，外泌体具有广泛性稳定性及可修饰性的优势，可以更好地反映机体状态，目前已有多种疾病的外泌体检测试剂盒上市，随着外泌体研究的深入，其有望成为呼吸系统疾病预测、诊断和病情评估的新途径。干细胞来源的外泌体具有干细胞的再生修复功能，且具有低免疫原性、无致畸性、耐低温、易于运输和保存的优势，作为无细胞的干细胞治疗技术为呼吸系统疾病带来新的方向。外泌体在自然界中广泛存在，研究者可以针对不同的疾病特点对其进行改造，有望实现外泌体的靶向治疗。但目前人们对外泌体的认识尚浅，其形成机制、提取及鉴定标准、质量控制等问题需进一步探索。
* 参考文献略
作者：刘培培 杨晟楠 代华平 王辰
单位：中国医学科学院 北京协和医学院 哈尔滨医科大学 中日友好医院呼吸中心呼吸与危重症医学科 国家呼吸临床研究中心 中国医学科学院呼吸病学研究院